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文檔簡介
1、目的:構(gòu)建Fas基因真核表達質(zhì)粒Pbk-Fas并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入舌鱗癌Tca8113細胞,不同濃度的順鉑作用于轉(zhuǎn)染前后的Tca8113細胞。探討Fas基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合應(yīng)用順鉑對舌鱗癌Tca8113細胞的殺傷作用,以期應(yīng)用較低的順鉑濃度獲得較大的細胞殺傷和凋亡誘導(dǎo)作用,減少大劑量藥物應(yīng)用帶來的毒性,為臨床口鱗癌Fas基因治療提供實驗依據(jù)。
方法:取對數(shù)生長期淋巴細胞,用RT-PCR反轉(zhuǎn)錄成Cdna擴增Fas基因全長,亞克隆到真核表達載
2、體Pbk-CMV內(nèi),構(gòu)建出重組真核表達質(zhì)粒Pbk-Fas。脂質(zhì)體法將Pbk-Fas轉(zhuǎn)染Tca8113細胞。取已轉(zhuǎn)導(dǎo)入構(gòu)建好Fas基因真核表達質(zhì)粒Pbk-Fas的舌鱗癌Tca8113細胞,將其分為未轉(zhuǎn)染Fas基因組,轉(zhuǎn)染Fas基因兩組,每組1×105/ml各100μl。將2組細胞分別接種至96孔板,加入100μl順鉑,使其最終濃度分別為1,5,10,20,40μg/ml,用MTT法檢測順鉑對轉(zhuǎn)染前后Tca8113細胞的抑制率,流式細胞儀測
3、定轉(zhuǎn)染前后不同濃度順鉑誘導(dǎo)Tca8113細胞的凋亡。
結(jié)果:
1.Fas基因真核表達質(zhì)粒Pbk-Fas成功構(gòu)建,重組質(zhì)粒Pbk-Fas經(jīng)酶切和測序鑒定,表明均含有大小正確的Fas基因片段。
2.MTT法檢測細胞抑制率的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組 Tca8113細胞的增殖抑制作用隨著鉑濃度的升高而升高,分別為57.39%±0.27%,61.81%±0.28%,67.08%±0.25%,75.44%±.030%
4、,78.33%±0.23%,未轉(zhuǎn)染組Tca8113細胞分別為29.60%±0.27%,33.00%±.0.35%,37.88%±0.36%,41.43%±0.27%,47.15%±0.25%。與未轉(zhuǎn)染組比較,差異有顯著性(P<0.01),表明Fas基因轉(zhuǎn)染能增加順鉑對舌鱗癌Tca8113細胞的增殖抑制率。
3.流式細胞儀檢測的結(jié)果顯示:未轉(zhuǎn)染組的Tca8113細胞的凋亡率分別為7.3%±0.2%,11.2%±0.3%,12
5、.3%±0.5%,13.4%±0.5%,14.6%±0.3%%;轉(zhuǎn)染組的Tca8113細胞的凋亡率分別為11.4%±0.2%,25.2%±0.6%,31.3%±0.4%,37.4%±1.2%,38.6%±1.4%。對未轉(zhuǎn)染組,順鉑加入對Tca8113細胞的誘導(dǎo)凋亡作用無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),終濃度為1,5,10,20μg/ml的順鉑誘導(dǎo)Tca8113誘導(dǎo)凋亡有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。順鉑對轉(zhuǎn)染后的Tca8113細胞有更明顯的誘
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