羅漢果葫蘆二烯醇的生物合成及葫蘆烷型三萜生物活性研究.pdf

1、羅漢果甜苷，是一種葫蘆烷型三萜皂苷，不僅是傳統(tǒng)中藥羅漢果的主要活性成分，還是非糖類純天然甜味劑。藥理學(xué)研究表明羅漢果甜苷具有鎮(zhèn)咳祛痰、潤肺保肝，抗炎、抗癌、降血糖等作用，已成為為數(shù)不多的從中藥中發(fā)掘出來的具有治療功能的新型甜味劑。在羅漢果甜苷的生物合成途徑中，葫蘆二烯醇合酶是葫蘆烷型三萜骨架合成的第一個限速酶，也是此條途徑唯一的環(huán)化酶，可催化底物2，3-氧化鯊烯生成葫蘆二烯醇。隨后葫蘆二烯醇在P450酶和和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，依次形

2、成羅漢果醇和羅漢果苷。葫蘆二烯醇是葫蘆烷型三萜化合物羅漢果苷和葫蘆素的基本母核，具有抗炎、癌細(xì)胞防治功效，與很多萜類相似，葫蘆二烯醇在植物中的含量很低，因而限制了其規(guī)模化生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。本文利用合成生物學(xué)方法在釀酒酵母中構(gòu)建葫蘆二烯醇合成途徑，經(jīng)途徑和發(fā)酵過程優(yōu)化，為實(shí)現(xiàn)葫蘆二烯醇及其下游產(chǎn)物的生物合成奠定了有利基礎(chǔ)。此外，還以羅漢果甜苷V及其前體羅漢果醇和葫蘆二烯醇為研究對象，進(jìn)行體外活性及大鼠血漿中藥代動力學(xué)研究，為葫蘆烷型化合物的

3、開發(fā)利用提供了理論依據(jù)?，F(xiàn)將主要研究結(jié)果敘述如下:
　　(1)構(gòu)建了葫蘆二烯醇酵母表達(dá)體系在對比酵母菌株生長速率、鯊烯底物的前提下，初步選擇改造實(shí)例豐富，代謝旺盛的優(yōu)勢酵母菌株BY4742作為底盤菌株。同源CS基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后導(dǎo)入釀酒酵母，實(shí)現(xiàn)了葫蘆二烯醇在釀酒酵母中的合成，而且表達(dá)SgCS基因獲得葫蘆二烯醇產(chǎn)量可達(dá)7.30mg/L。
　　(2)建立了多種代謝調(diào)控策略克隆到酵母轉(zhuǎn)錄因子UPC2基因，轉(zhuǎn)化到重組酵母菌株后，

4、GC-MS分析產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)UPC2基因可提高葫蘆二烯醇產(chǎn)量，是出發(fā)菌株產(chǎn)量的3倍，為21.47mg/L。此外，外源物質(zhì)的添加對產(chǎn)物葫蘆二烯醇的合成具有一定的促進(jìn)作用，茉莉酸甲酯添加濃度為0.5mg/L時，產(chǎn)物葫蘆二烯醇與對照相比約增加了50％;水楊酸添加濃度為0.5mg/L時，產(chǎn)物葫蘆二烯醇與對照相比約增加了35％。
　　(3)發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)優(yōu)化了重組酵母發(fā)酵生產(chǎn)葫蘆二烯醇的培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)以200rpm，pH5.0，空氣

5、流量50L/h在30℃條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)有利于酵母菌株生長和產(chǎn)物葫蘆二烯醇的積累。并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵可顯著提高目標(biāo)產(chǎn)物單位體積產(chǎn)量和菌株BY4742-SgCS的生物量，最終產(chǎn)物滴度為16mg/L，約為對照組的2.8倍。此外，在補(bǔ)加葡萄糖的同時添加無機(jī)鹽溶液，可進(jìn)一步提高產(chǎn)物約25％，最終得到產(chǎn)物滴度為20mg/L。
　　(4)體外藥理活性腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性研究結(jié)果表明，羅漢果醇(MO)對A-54

6、9、BEL-7402和HL-60細(xì)胞均具有一定抑制作用;羅漢果苷V(MV)和葫蘆二烯醇(CU)對A-549細(xì)胞具有一定抑制作用，可作為候選藥物進(jìn)行后續(xù)研究。AMPK激活試驗(yàn)結(jié)果表明，受試物MO和MV在分子水平可以激活A(yù)MPK，MO的最大激活倍數(shù)和EC50分別為2.3倍和4.2μM;MV的最大激活倍數(shù)和EC50分別為2.4倍和20.4μM。這一發(fā)現(xiàn)為深入了解羅漢果甜苷的降糖機(jī)制提供了線索，并為天然AMPK激動劑類新型抗糖尿病藥物的發(fā)現(xiàn)提供

7、參考。
　　(5)藥代動力學(xué)研究建立了同時測定大鼠血漿中MV及其苷元MO的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法，并進(jìn)行了完整的方法確證。大鼠靜脈注射給藥MV后，可在大鼠血漿中同時檢測到MV和MO的存在，2min時MO與MV的濃度比僅為4.61％;但隨著時間的推移，MO與MV的濃度比越來越大，直至6h時二者的比值為132％，表明MV在大鼠體內(nèi)可迅速脫糖，生成代謝產(chǎn)物MO。大鼠灌胃給藥MV后，在大鼠血漿中未檢出MV的存在，但可檢出

8、少量的MO，并經(jīng)濃度和劑量歸一化處理后測得生物利用度值為8.73±1.46％。大鼠靜脈注射給藥MO后，MO在大鼠體內(nèi)的消除半衰期為1.40±0.09h。大鼠灌胃給藥MO后，MO在大鼠體內(nèi)的消除半衰期為2.41±0.11h，達(dá)峰時間tmax為0.39±0.10h，并經(jīng)劑量歸一化處理后獲得的絕對生物利用度值為10.3±2.15％。結(jié)果表明，口服給藥MV及其苷元MO后，MO可迅速吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，約在0.38h達(dá)峰濃度。然而，生物利用度相對偏