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文檔簡介
1、目的:
通過對MicroRNA145、Adducin3及GBP-1在膽道閉鎖(biliary atresia,BA)患兒肝臟組織中的表達水平變化,探討MicroRNA145-Adducin3通路及GBP-1在膽道閉鎖發(fā)病中增殖紊亂的作用及其作用機制。
方法:
選取深圳市兒童醫(yī)院2013年1月至2016年1月收治的臨床及病理診斷為膽道閉鎖的患兒60例(研究組),對照組選取同期年齡在6個月之內(nèi)的非膽汁淤積性肝病
2、且肝功能正常的患兒54例。第一部分:通過裂解研究組及對照組的肝組織并提取其總RNA后,分別用mRNA RT-PCR及MicroRNA RT-PCR法反轉錄、qPCR熒光定量分析法,檢測BA肝組織中的ADD3 mRNA及MicroRNA-145的表達水平。第二部分:構建高表達MicroRNA-145、低表達Microrna-145慢病毒,并分別轉染至HepG2細胞內(nèi),用RT-PCR反轉錄及qPCR熒光定量、western blot方法分別
3、檢測不同MicroRNA-145表達量的細胞內(nèi)ADD3mRNA表達水平和蛋白表達水平。第三部分:檢測GBP-1在不同程度肝臟纖維化肝臟組織中的表達,并利用自動醫(yī)學彩色圖像分析系統(tǒng)對其進行定量。第四部分:擬構建GBP1基因慢病毒載體,轉染肝臟細胞從而上調(diào)其在肝臟細胞中的表達,探討該基因高表達后對其下游因子尤其是MMPs表達的影響及對肝臟細胞的影響。
結果:
第一部分: ADD3 mRNA在BA組肝組織中表達量為4.63
4、8±0.3327,在對照組中表達為1.167±0.1053;MicroRNA-145在BA組肝組織中表達為0.1578±0.03217,在對照組中表達為0.4557±0.1244。BA組肝組織中ADD3較對照組的明顯升高(p<0.05),MicroRNA-145較對照組的明顯降低(p<0.05)。第二部分:空白對照組的HepG2細胞內(nèi)存在ADD3 mRNA及蛋白質(zhì)的基礎表達量,轉染高表達MicroRNA-145后的HepG2細胞,其AD
5、D3mRNA水平及蛋白質(zhì)水平均較對照組細胞的低,而轉染低表達MicroRNA-145后的細胞,其ADD3mRNA水平及蛋白質(zhì)水平均明顯低于對照組細胞。第三部分:GBP1在對照組肝臟組織中呈陰性表達;在BA肝臟組織中呈現(xiàn)不同程度表達,隨著肝臟纖維化程度的加重,GBP-1表達水平增高。第四部分:TUNEL法檢測HepG2凋亡情況發(fā)現(xiàn),空載體質(zhì)粒和未轉染對照HepG2細胞未檢測到凋亡,而轉染Pcmv6-gbp1的HepG2細胞出現(xiàn)較多凋亡細胞
6、。ELISA定量檢測發(fā)現(xiàn),MMP-1和MMP-2在pCMV6-gbp1轉染HepG2細胞上清中表達降低,與對照組和空載體質(zhì)粒組統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
結論:
1、ADD3的過度表達可能與BA的發(fā)病相關。2、MicroRNA-145可能通過靶向作用于ADD33'UTR序列來改變ADD3的表達,而誘發(fā)了BA的發(fā)生。3、GBP1可能與BA肝臟組織肝纖維化密切相關。4、GBP1可能通過促進肝細胞凋亡和抑制MMP-1和M
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