AGEs-AGER1-Sirt1通路在糖尿病角膜病變中的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病角膜病變是糖尿病的一種常見并發(fā)癥，可導致糖尿病患者視功能嚴重減退。糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的累積在糖尿病角膜病變中發(fā)揮重要作用。既往研究認為，AGEs可與糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）結合，啟動細胞活性氧（ROS）生成、炎癥反應、凋亡，從而促進糖尿病角膜病變的發(fā)生發(fā)展。近來研究發(fā)現(xiàn)，AGEs的另一受體——糖基化終末產(chǎn)物受體-1（AGER1）在糖尿病患者中受到抑制，提示其可能參與糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，但其在糖

2、尿病角膜病變中是否具有作用及相關機制目前尚無研究。因此，本課題擬以人角膜上皮細胞（HCEC）及鏈脲佐菌素(STZ)誘導的Ⅰ型糖尿病小鼠為實驗模型，通過體內(nèi)外的功能研究探討AGER1在AGEs介導的糖尿病角膜病變中的作用及機制。
　　方法：
　　1.通過免疫組化、免疫熒光、實時定量PCR（RT-PCR）及Western blot（WB）等方法檢測糖尿病患者、I型（STZ小鼠、INS2Akita/+小鼠）、II型（BKS-db/

3、db）糖尿病小鼠角膜中AGEs及AGER1相關通路基因的表達情況，觀察AGER1是否參與糖尿病角膜病變過程。
　　2.以HCEC為體外細胞模型，外源加入AGEs-BSA、AGER1干擾RNA及AGER1過表達質(zhì)粒后，分別以MTT法檢測細胞增殖能力變化、劃痕法檢測細胞遷移能力變化、AV/PI法檢測凋亡水平變化、DCFH-DA法檢ROS水平變化、RT-PCR及WB檢測AGER1、依賴NAD+的組蛋白去乙?；福⊿irt1）、RAGE等

4、相關通路基因的表達變化，探討AGER1在AGEs介導的糖尿病角膜病變中的具體作用及機制。
　　3.以C57BL/6J小鼠為動物模型，結膜下注射AGEs-BSA，通過小鼠上皮刮除實驗研究AGEs對小鼠角膜上皮刮除后愈合的影響，通過免疫熒光、RT-PCR檢測結膜下注射AGEs-BSA對AGER1、Sirt1、RAGE等相關通路基因表達的影響；以STZ小鼠為糖尿病模型，通過慢病毒轉(zhuǎn)染對角膜組織行AGER1過表達，RT-PCR檢測AGER

5、1過表達后對AGER1、Sirt1、RAGE等相關通路基因表達的影響，探討AGER1過表達對糖尿病小鼠角膜的作用及分子作用機制。
　　結果：
　　1.與對照相比，糖尿病患者及STZ、INS2Akita/+、BKS-db/db小鼠角膜組織中都有相對較多的AGEs的積累且主要位于上皮下基底膜，并都表現(xiàn)出AGER1受體表達顯著減少；STZ及INS2Akita/+、BKS-db/db小鼠角膜組織中RAGE受體表達顯著增多；STZ及I

6、NS2Akita/+小鼠角膜組織Sirt1表達顯著減少；STZ小鼠全角膜組織乙?；暮宿D(zhuǎn)錄因子-kB（Acl-NF-kB）表達顯著升高、促炎的腫瘤壞死因子（TNF-α）（P＜0.01）表達顯著升高、抗凋亡因子B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）（P＜0.01）表達顯著減少；STZ小鼠角膜上皮促炎因子TNF-α（P＜0.01）、白介素-1（IL-1）（P＜0.05）及白介素-6（IL-6）（P＜0.01）表達都顯著升高；BKS-db/db小鼠全

7、角膜促炎因子IL-6表達顯著升高。
　　2. AGEs-BSA處理HCEC后，細胞增殖能力（P＜0.05）、遷移能力（P＜0.05）都顯著降低，ROS生成增多，AGER1受體及Sirt1表達顯著減少，而RAGE及Acl-NF-kB表達則顯著增加。通過干擾RNA對AGER1干擾后，HCEC增殖能力顯著降低（P＜0.01），ROS生成增多，凋亡增多；分子檢測發(fā)現(xiàn)AGER1干擾使Sirt1蛋白表達量降低，RAGE受體、Acl-NF-kB

8、表達量升高，促炎因子IL-1（P＜0.01）與促凋亡因子Bcl-2相關X蛋白（Bax）（P＜0.05）顯著升高。 AGER1過表達后RAGE（P＜0.01）、Acl-NF-kB表達受到顯著抑制，而Sirt1蛋白表達變化不著，促炎與促凋亡因子TNF-α、IL-1、IL-6、Bax表達均顯著降低（P均＜0.01）。
　　3. STZ小鼠角膜上皮刮除2.5mm后24h、36h角膜上皮缺損率較C57BL/6J對照組顯著升高（P均＜0.05

9、）；結膜下注射AGEs-BSA后12h、24h、36h C57BL/6J小鼠角膜上皮愈合均顯著延遲（P均＜0.05），且在mRNA水平上AGER1（P＜0.01）、Sirt1（P＜0.01）、Bcl-2（P＜0.01）表達顯著減少，RAGE（P＜0.05）、IL-1（P＜0.01）、IL-6（P＜0.01）、Bax（P＜0.05）表達顯著升高，而Acl-NF-kB蛋白表達增加。AGER1過表達使體外培養(yǎng)的STZ小鼠角膜組織中促炎因子TN

10、F-α（P＜0.05）及促凋亡因子Bax（P＜0.01）表達顯著降低。
　　結論：
　　1.Ⅱ型糖尿病患者及糖尿病模型小鼠角膜中均存在 AGEs累積，且 AGER1受體表達降低、RAGE受體表達升高。外源性AGEs可使小鼠角膜上皮修復顯著延遲。
　　2.糖尿病模型小鼠促炎癥、凋亡基因表達增加，提示炎癥與凋亡可能參與糖尿病角膜病變的發(fā)病機制。
　　3. AGEs能夠顯著抑制HCEC的增殖、遷移，并促進HCEC細胞R

11、OS產(chǎn)生，在體內(nèi)、體外促進炎癥、凋亡發(fā)生，在體內(nèi)通過AGER1/Sirt1、RAGE/Acl-NF-kB兩條受體通路發(fā)揮作用。
　　4. AGER1干擾可使 RAGE表達上升，加重 AGEs對 HCEC的不良影響；而AGER1過表達則使RAGE表達下降，減輕這些作用。保護性受體AGER1與損傷性受體RAGE可能存在與AGEs的競爭性結合，兩受體通路有相互拮抗的作用。
　　5. AGER1受體在糖尿病角膜病變中起保護性作用，且