Keap1-Nrf2通路在子癇前期氧化應(yīng)激發(fā)病機制中調(diào)控作用的研究.pdf

1、子癇前期(Preeclampsia，PE)是妊娠期特有的臨床綜合征，以妊娠20周后出現(xiàn)新發(fā)高血壓和蛋白尿為主要特點，其發(fā)病率約為2-9.4％。PE是發(fā)展中國家產(chǎn)婦死亡和發(fā)病的主要原因之一，但是PE發(fā)生發(fā)展的病理機制尚不清楚。目前，PE發(fā)展進程可分為以下兩個階段:第一階段是胚胎滋養(yǎng)層入侵到母體子宮肌層，導(dǎo)致子宮螺旋動脈重塑不足，從而使胎盤陷入缺血和缺氧環(huán)境，引發(fā)胎盤釋放多種促炎細(xì)胞因子和血管生成因子等，引起母體全身炎癥。第二階段，全身炎癥

2、反應(yīng)所導(dǎo)致的母體血管系統(tǒng)的內(nèi)皮功能障礙與腎功能下降引起的血壓升高為此階段的主要特征，最終引起以母體高血壓和蛋白尿為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。緩解母體癥狀的唯一有效途徑是胎盤和胎兒的娩出。既往研究表明，PE患者的胎盤氧化應(yīng)激反應(yīng)失衡，并且胎盤局部氧化應(yīng)激過度，可誘發(fā)滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能損傷，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加和侵襲能力下降，引起母親系統(tǒng)性血管內(nèi)皮功能失調(diào)和白細(xì)胞激活;而Keap1/Nrf2信號通路則在PE的氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮保護作用，但是其作

3、用機制尚不清楚。因此，深入探討PE的氧化應(yīng)激發(fā)生機制，尋求有效的治療靶點，對緩解PE患者癥狀、延長胎兒在母體時間、降低PE患者死亡率具有重要臨床意義。
　　氧化應(yīng)激(Oxidative Stress，OS)是機體的應(yīng)激反應(yīng)，即體內(nèi)的活性氧族(Reactive Oxygen Species，ROS)及活性氮族(Reactive Nitrogen Species，RNS)產(chǎn)生過多，清除過少，最終導(dǎo)致氧化/抗氧化體系失衡，傾向于氧化，引

4、起組織損傷。與非妊娠狀態(tài)相比，正常妊娠期間母體活性氧生成量增加。隨著胎盤成熟，血管形成，胎盤被變成富氧環(huán)境，活性氧的增加刺激妊娠期間抗氧化系統(tǒng)的增強。增強的抗氧化系統(tǒng)有效補償了OS的氧化作用。與正常妊娠相比，PE患者OS表達(dá)增加和抗氧化系統(tǒng)的表達(dá)增強，其特征在于活性氧(ROS)在循環(huán)和組織中表達(dá)增加。
　　既往研究結(jié)果顯示Keap1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein1)/N

5、rf2(nuclear factor-E2-related factor2)信號通路在抗氧化、抗炎方面扮演了重要的角色。正常狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2與其負(fù)調(diào)控因子Keap1結(jié)合形成Keap1/Nrf2復(fù)合物，大部分Nrf2被Keap1介導(dǎo)的泛素化降解，因此其處于活性相對抑制狀態(tài);而應(yīng)激的狀態(tài)會引起Keap1構(gòu)象的改變，或者由高度活性的氧化物直接促使Nrf2磷酸化，導(dǎo)致Nrf2與Keap1解離而活化，活化的Nrf2進入細(xì)胞核，形成下一步

6、連鎖反應(yīng)，從而與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)的結(jié)構(gòu)相結(jié)合，激活下游的多種抗氧化基因。因此Keap1/Nrf2信號調(diào)節(jié)通路在PE的發(fā)病過程中有著重要的作用，研究該機制具有重要臨床意義。
　　目的:
　　1.明確不同分組氧化應(yīng)激水平的變化及Nrf2對于氧化應(yīng)激水平的抑制作用。通過檢測不同分組HTR8/SVneo細(xì)胞內(nèi)CAT、GSH-Px、SOD酶活性，進一步明確Nrf2對于氧

7、化應(yīng)激相關(guān)活性酶作用的機制。
　　2.在前期實驗工作基礎(chǔ)上，進一步從細(xì)胞水平-臨床水平，采用蛋白印跡雜交、qRT-PCR、siRNA、ELISA等相關(guān)技術(shù)手段的，明確Keap1/Nrf2通路對PE細(xì)胞模型中滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/SVneo生物學(xué)功能以及PE患者氧化應(yīng)激水平的影響。
　　方法:
　　對于人早孕期絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR8/SVneo進行細(xì)胞培養(yǎng)、復(fù)蘇、傳代。通過活性氧及氧化應(yīng)激相關(guān)酶CAT、GSH-Px及SOD

8、酶活性的測定，以明確不同分組HTR8/Svneo及胎盤組織氧化應(yīng)激水平;并通過檢測血漿MMPs預(yù)測子癇前期的發(fā)病風(fēng)險。應(yīng)用RNAi方法設(shè)計siRNA-Nrf2，對靶基因進行基因沉默實驗，以明確靶基因的功能;應(yīng)用qRT-PCR方法確認(rèn)Keap1/Nrf2通路與氧化應(yīng)激相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平的差異，Western blot方法確認(rèn)Keap1/Nrf2通路與氧化應(yīng)激相關(guān)分子蛋白的表達(dá)差異。采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(Me

9、ans±SD)表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗，多組間的比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001均為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染慢病毒后Nrf2mRNA表達(dá)結(jié)果示:Si-Nrf2組較Si-NC組Nrf2mRNA的表達(dá)量明顯減低(P＜0.001);蛋白免疫印跡法檢測Nrf2蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示:Si-Nrf2組較Si-NC組明顯降低，差異有顯

10、著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。
　　2.HTR8/SVneo細(xì)胞H/R組ROS水平與Non-treated組相比明顯升高(p＜0.01);對Nrf2進行基因沉默后，Nrf2siRNA+H/R組ROS水平與H/R組相比明顯增高(p＜0.01)。
　　3.HTR8/SVneo細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧條件下，氧化應(yīng)激相關(guān)酶(CAT、GSH-Px、SOD)活性顯著低于處理前，這體現(xiàn)在H/R組氧化應(yīng)激酶水平較正常對照組明顯降低(P＜0.01

11、)。SiRNA+H/R組HTR8/SVneo細(xì)胞內(nèi)CAT、GSH-Px、SOD活性下降顯著(P＜0.01)。
　　4.缺氧復(fù)氧后HTR8/SVneo細(xì)胞Keap1mRNA表達(dá)輕度低于正常對照(P＜0.05);HTR8/SVneo細(xì)胞缺氧復(fù)氧后Nrf2mRNA表達(dá)明顯高于正常對照組(P＜0.001);HTR8/SVneo細(xì)胞缺氧復(fù)氧后HO-1mRNA表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞(P＜0.001)。
　　5.HTR8/SVneo細(xì)胞

12、缺氧復(fù)氧后Keap1蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對照組(P＜0.05);而缺氧復(fù)氧后HTR8/SVneo細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞(P＜0.001);HO-1蛋白表達(dá)水平在缺氧復(fù)氧后也明顯高于正常細(xì)胞(P＜0.001)。
　　6.正常孕婦和重度子癇前期患者的孕周、收縮壓、舒張壓以及新生兒體重均存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　7.孕中期PE患者的MMP-2水平高于正常參與者，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。另一方面，PE患者

13、MMP-9血漿水平略低于正常懷孕組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。比較MMP-2/MMP-9比率，發(fā)現(xiàn)PE組的比率明顯高于正常妊娠組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。
　　MMP-2用于預(yù)測PE的ROC曲線下面積僅為0.563，95％置信區(qū)間(CI)為0.497-0.629(P＞0.05)。而MMP-9的預(yù)測PE的ROC曲線下面積為0.587，95％CI為0.522-0.652，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。ROC

14、曲線下使用MMP-2/MMP-9比率預(yù)測PE的曲線下面積為0.841，95％CI為0.797-0.886(P＜0.001)。
　　8.重度子癇前期患者胎盤組織CAT(P＜0.001)、GSH-Px(P＜0.01)、SOD(P＜0.01)酶活性均低于正常胎盤組織。
　　9.重度子癇前期患者胎盤組織Keap1mRNA表達(dá)水平稍低于與正常胎盤組織(P＜0.05);重度子癇前期患者胎盤組織Nrf2mRNA表達(dá)水平明顯高于與正常胎盤組

15、織(P＜0.001);重度子癇前期患者胎盤組織HO-1mRNA表達(dá)水平明顯高于與正常胎盤組織(P＜0.001)。
　　10.重度子癇前期患者胎盤組織Keap1蛋白表達(dá)水平稍低于與正常胎盤組織(P＜0.05);重度子癇前期患者胎盤組織Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯高于與正常胎盤組織(P＜0.01);重度子癇前期患者胎盤組織HO-1蛋白表達(dá)水平明顯高于與正常胎盤組織(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　本研究通過檢測不同類型HTR

16、8/SVneo細(xì)胞內(nèi)活性氧、CAT、GSH-Px、SOD酶活性，進一步明確氧化應(yīng)激時活性氧水平上升、其相關(guān)酶活性下降及Nrf2對于氧化應(yīng)激相關(guān)活性酶作用的機制;在mRNA及蛋白水平，Keap1/Nrf2信號通路在缺氧復(fù)氧狀態(tài)下表達(dá)水平明顯改變，提示可通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2信號通路抑制氧化應(yīng)激的水平。孕中期患者血漿MMPs水平對子癇前期有重要的預(yù)測意義。不同樣本的氧化應(yīng)激相關(guān)活性酶因臨床狀態(tài)不同而有明顯差異;重度子癇前期患者胎盤組織