探討巨噬細胞TREM-1通路和淋巴細胞Tim-3通路在膿毒血癥發(fā)病中的作用機制.pdf

1、本文內容分為三部分進行介紹：
　　第一部分 TREM-1通路在膿毒血癥中的表達及機制研究
　　目的：研究 TREM-1分子在膿毒血癥各類炎性細胞上的表達及TREM-1通路在膿毒血癥發(fā)病中的作用機制。
　　方法：構建 BALB/c小鼠腹腔膿毒血癥模型,收獲腹腔細胞,應用流式細胞儀檢測TREM-1分子在各類炎性細胞上的表達;分離正常小鼠腹腔巨噬細胞,加入銅綠假單胞菌共培養(yǎng),在培養(yǎng)液中加入 TREM-1融合蛋白封閉 TREM

2、1/DAP12通路,應用瑞氏染色技術檢測巨噬細胞吞噬能力變化,應用ELISA技術檢測巨噬細胞分泌炎性因子水平變化,應用實時定量 PCR技術檢測巨噬細胞表面協(xié)同刺激分子表達水平;構建BALB/c小鼠腹腔膿毒血癥模型,使用TREM-1融合蛋白及對照 IgG進行治療,對膿毒血癥小鼠生存時間進行統(tǒng)計;構建 BALB/c小鼠腹腔膿毒血癥模型,使用TREM-1融合蛋白及對照 IgG進行治療,24小時后處死小鼠,收獲外周血用于分析血清中IL-1、TN

3、F-α、MCP-1等炎性因子水平變化,收獲腹腔細胞應用流式細胞儀檢測 CD40、CD86等協(xié)同刺激分子在巨噬細胞上的表達變化。
　　結果：TREM-1分子大量表達于小鼠中性粒細胞和巨噬細胞上,而在淋巴細胞上不表達,且在銅綠假單胞菌急性感染引起的膿毒血癥模型中,TREM-1分子在巨噬細胞及中性粒細胞上的表達明顯增高;使用TREM-1融合蛋白阻斷該通路后顯著延長膿毒血癥小鼠死亡時間;使用TREM-1融合蛋白阻斷該通路后在體內外均能顯著

4、降低巨噬細胞分泌 IL-1、TNF-α、MCP-1等炎性因子能力,但對巨噬細胞吞噬功能無顯著影響;使用TREM-1融合蛋白阻斷該通路后在體內外均能顯著降低其表面 CD40、CD86等協(xié)同刺激分子表達,從而影響巨噬細胞抗原提呈功能。
　　結論：TREM-1通路表達于膿毒血癥相關巨噬細胞與中性粒細胞,阻斷該通路可以顯著減少巨噬細胞釋放 IL-1、TNF-α等炎性因子能力,且顯著降低巨噬細胞活化、抗原提呈功能,從而顯著降低膿毒血癥發(fā)生時

5、過度放大的炎性反應,最終明顯延長膿毒血癥小鼠存活。
　　第二部分研究Tim-3信號通路和Th17細胞的相關性以及在肺炎克雷伯菌感染引起的肺炎中的作用
　　目的：研究 Tim-3信號通路和Th17細胞的關系以及在急性肺炎發(fā)病時的作用機制。
　　方法：分離正常小鼠脾臟淋巴細胞,加入特定的細胞因子誘導 T細胞向 Th17細胞分化,一段時間后檢測 Th17細胞上 Tim-3分子表達水平,且加入 Galectin-9激活 Tim

6、-3通路后檢測 Th17細胞凋亡變化;建立 BALB/c小鼠肺炎克雷伯菌急性肺炎感染模型,使用Galectin-9或對照 PBS治療急性肺炎小鼠,記錄各組小鼠存活時間;建立 BALB/c小鼠肺炎克雷伯菌急性肺炎感染模型,使用Galectin-9或對照 PBS治療急性肺炎小鼠,不同時間點處死小鼠并收獲外周血血清檢測 IL-17、IFN-γ、IL-4、G-CSF、MIP-2等細胞因子水平,同時檢測脾臟 CD4+及CD8+T細胞絕對值、外周血

7、中性粒細胞絕對值、肺組織內細菌含量等指標變化。
　　結果：脾臟淋巴細胞經 CD3抗體、CD28抗體、TGF-β、IL-6誘導后明顯向 Th17細胞分化,且流式檢測結果顯示 Tim-3分子在誘導的Th17細胞上大量表達,達到65％;經誘導的Th17細胞加入 Galectin-9激活 Tim-3通路后可以引起 Th17細胞凋亡增加,從而顯著降低 IL-17分泌;體內使用Galectin-9融合蛋白治療肺炎克雷伯菌感染引起的急性肺炎可以

8、加速小鼠死亡,原因可能為使用Galectin-9激活 Tim-3通路后減少IL-17與 IFN-γ水平,從而顯著降低 G-CSF和MIP-2分泌。G-CSF和MIP-2分泌減少造成中性粒細胞增殖過少,不足以對抗體內的肺炎克雷伯菌,從而造成大量細菌在肺組織內繁殖,加速肺炎小鼠死亡。
　　結論：Tim-3分子在 Th17細胞上表達且激活 Tim-3通路同樣引起 Th17細胞凋亡。使用Galectin-9激活該通路后可以顯著降低體內外

9、IL-17水平,間接引起中性粒細胞增殖減少,導致大量細菌在組織內繁殖,從而加速肺炎小鼠的死亡。
　　第三部分 CD4+T細胞、CD8+T細胞及DC細胞通過Tim-3信號通路調節(jié)膿毒血癥小鼠存活
　　目的：研究 Tim-3分子在膿毒血癥各類炎性細胞上的表達及Tim-3通路調節(jié)膿毒血癥的作用機制。
　　方法：構建銅綠假單胞菌腹腔感染引起的BALB/c小鼠膿毒血癥模型,收獲小鼠腹腔總細胞,使用流式細胞儀檢測 Tim-3分子在

10、各類炎性細胞上的表達;構建銅綠假單胞菌腹腔感染引起的BALB/c小鼠膿毒血癥模型,給予 Tim-3封閉蛋白或對照 IgG進行治療,觀察各組小鼠存活時間,并定期處死小鼠收獲血清檢測 IL-1、TNF-α、IFN-γ、IL-4等炎性因子變化;體外分離小鼠脾臟淋巴細胞,加入 LPS進行誘導,加入 Tim-3封閉蛋白阻斷該通路,48小時后檢測各類炎性因子分泌變化,檢測阻斷該通路后淋巴細胞增殖、凋亡等功能變化;構建小鼠膿毒血癥模型,給予 Tim-

11、3封閉蛋白或對照 IgG進行治療,檢測外周血及腹腔炎性細胞數(shù)量及銅綠假單胞菌細菌含量,體內檢測淋巴細胞、DC細胞增殖、活化改變,檢測巨噬細胞吞噬、凋亡改變。
　　結果：Tim-3分子在膿毒血癥腹腔 CD4+T細胞、 CD8+T細胞、CD11c+DC細胞上表達,而在中性粒細胞、巨噬細胞上不表達,且膿毒血癥時 Tim-3分子在腹腔 CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD11c+DC細胞上和正常小鼠相比,表達顯著增高,分別達到28％、38

12、％及23％;使用Tim-3封閉蛋白阻斷該通路后可以顯著降低 IL-1、TNF-α、IFN-γ等炎性因子分泌,從而顯著延長膿毒血癥小鼠存活;體外使用Tim-3封閉蛋白阻斷該通路引起淋巴細胞增殖與活化減少、但凋亡增加;體內使用Tim-3封閉蛋白治療膿毒血癥小鼠同樣減少 T淋巴細胞與 DC細胞活化;體內使用Tim-3封閉蛋白治療膿毒血癥小鼠對巨噬細胞吞噬功能無影響,但可以增加趨化至腹腔的巨噬細胞絕對值,減少腹腔細菌含量,同時體內阻斷該通路可以