膽道閉鎖相關基因篩選及TGFβ1-BMP-Smad信號轉導通路在其發(fā)病中作用的研究.pdf

1、目的：
　　膽道閉鎖(biliary atresia，BA)是嬰兒期累及肝內外膽管、最終導致終末期肝硬化的嚴重肝臟疾病，其特點為膽管進行性的炎癥、纖維化，并最終消失[1-4]，即使在膽道重建術(Kasai術)后大多數患兒的肝臟病變也將持續(xù)進展，主要表現為逐漸加重的毛細膽管炎癥、纖維化、消失，最終約有80％的患者需肝移植（目前BA是兒童期肝移植的最常見原因，50％以上的兒童肝移植原發(fā)病變?yōu)槟懙篱]鎖[5,6]），Kasai術后10年靠

2、自體肝臟生存的另外約20％的患者仍有95％以上存在著進行性的膽管損傷和不同程度的肝硬化[7]。因此對于膽道閉鎖的治療只停留于手術重建肝外膽道顯然是不夠的，成功的治療應包括膽系纖維化進程的終止、膠原纖維基質的清除、正常肝臟結構的恢復、膽管上皮細胞基因表達和代謝功能的恢復等，因而，預防、終止及逆轉膽管進行性纖維化對于重塑肝內膽管、有效引流膽汁、防止膽汁淤積性肝硬化，進而達到根治至關重要，因而有必要探討新的治療靶點，以達到有效治療的目的。

3、r>　　基因芯片也稱為基因微陣列，是指在有限的載體上加載大量基因信號，可以用有限的標本，在短時間內、條件幾乎一致的情況下，檢測大量基因的表達情況，從而提供全面可靠的基因表達譜。目前基因芯片技術及生物信息學方法，以其高通量、高信息量等優(yōu)點，為研究分子與分子間復雜的相互作用提供了新的方法[8-10]。既往關于膽道閉鎖的研究以炎癥細胞或因子在發(fā)病中的作用為主，關于細胞之間及分子之間相互作用的研究較少。因此本研究借助基因芯片及生物信息學技術的發(fā)

4、現在基因組水平對基因表達譜及基因間的相互關系進行研究，以期發(fā)現在膽道閉鎖發(fā)病過程中的關鍵信號通路，并對其主要基因表達、突變及相互作用的關系進行探討。
　　最新的研究表明膽道閉鎖可能是一類病毒誘導的自身免疫性疾病，機體在致病因素的作用下對膽道特異性抗原產生了自身免疫損傷[13]。CTGF是TGF-β1重要的拮抗因子，與TGF-β1分享著某些共同的生物學功能，如促進成纖維細胞增殖、促進前膠原α1和纖維連接蛋白及整合素α5mRNA的表達

5、等，在EMT過程中，二者起協同作用，在致組織器官纖維化過程中，TGF-β1主要表達在纖維化的早期，而CTGF的持續(xù)表達則被認為是纖維化病變緩慢進展的重要因素[21,22]。體外實驗發(fā)現應用CTGF的中和抗體可以阻斷TGF-β1引起的EMT瀑布效應。而CTGF作為TGF-β1重要的下游效應介質，作用比較單一，僅在結締組織中表達，因而我們推測靶向性阻斷CTGF的表達可以干擾TGF-β1信號通路的激活，進而阻斷EMT和纖維化進程。如上所述，B

6、MP7是TGF-β1-BMP-Smad信號通路重要組成部分，通過與不同的受體結合在生物體內發(fā)揮重要生理功能，BMP7可逆向調節(jié)TGF-β1引起的EMT。綜上所述，我們推測在膽管上皮細胞EMT啟動的關鍵時間點，通過合適的方式在TGF-β1-BMP-Smad信號通路的兩個重要環(huán)節(jié)進行干預調節(jié)，必將影響膽管上皮細胞EMT的進程，最終使纖維化終止或逆轉。
　　方法：
　　一、實驗材料
　?。ㄒ唬?、臨床組織標本
　　收集近

7、三年來在我院治療并手術的膽道閉鎖病例13例，作為病例組。收集非消化系統疾病死亡尸檢患兒肝臟標本3例，做為對照組。術中無菌取肝臟組織，放入無RNA酶的錫紙中，立即至于液氮中保存。
　　（二）、實驗動物
　　體重18-22克的SPF級Balb/c小鼠25只（雄鼠:5只;雌鼠:20只）由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供，按照雄雌比例1∶4分籠飼養(yǎng)，雌鼠孕后分籠單獨飼養(yǎng)，小鼠出生后隨機分為實驗組（49只）及對照組（52只）。
　　

8、二、實驗方法
　?。ㄒ唬┠懙篱]鎖和正常肝臟組織基因表達譜差異的研究
　　膽道閉鎖忠兒肝臟組織標本3例;對照組由3例死于非消化系統疾病死亡尸檢患兒的肝臟標本，術中無菌留取肝臟組織標本。采用Trizol一步法提取組織的總RNA，反轉錄成cDNA，轉錄合成cRNA，合成的同時進行生物素標記。生物素標記的cRNA探針經片段化處理后與芯片雜交，掃描儀上掃描芯片。應用GenePix Pro6.0 software進行數據分析。將所獲探針

9、號于DAVID網站（http://david.abcc.ncifcrf.gov）中查詢出差異表達基因的生物學信息。根據差異倍數及P值篩選出最具有統計學意義的差異表達基因8個（包括表達上調的基因:AFP，HBA2，HBA1，HBD，LOC221136及表達下調的基因:SERPINA11，GLYATL1，PECR)，根據各差異表達基因在信號轉導通路中的內在聯系及其在BA患者的肝膽纖維化過程中的作用篩選出TGFβ1-BMP-Smad信號轉導通

10、路的關鍵調節(jié)基因2個（包括TGF-β1的重要下游效應介質CTGF的同名編碼基因及TGF-β1的拮抗蛋白BMP7的同名編碼基因）。留取膽道閉鎖患兒肝臟組織標本13例;死于非消化系統疾病患兒的肝臟組織標本3例。應用Real-time PCR的方法對TGFβ1-BMP-Smad信號轉導通路的關鍵調節(jié)基因CTGF、BMP7進行了研究，以驗證基因芯片的可靠性和可信度。
　?。ǘ㏕GFβ1-BMP-Smad信號轉導通路中的關鍵因子在膽道閉鎖

11、動物模型中的表達的研究
　　RRV病毒懸液對出生24h內的Balb/c鼠進行腹腔內注射，建立膽道閉鎖模型，對照組在相同時間內注入等量生理鹽水。此后連續(xù)觀察小鼠體重、皮膚顏色和大小便顏色的變化。分別在1、3、5、7、10、15、20天取膽管及肝臟組織進行石蠟包埋，連續(xù)切片行HE染色、免疫組織化學法及Western blot檢測TGFβ1-BMP-Smad信號轉導通路中的關鍵調節(jié)蛋白CTGF、BMP7的表達。Real-time PCR

12、檢測CTGF、BMP7兩種基因在各組中的表達。
　　結果：
　　1、膽道閉鎖和正常肝臟組織基因表達譜差異的研究
　　膽道閉鎖患兒肝臟組織與正常兒肝臟組織中表達差異在2倍以上且P值＜0.05的基因有7361條，其中上調的基因有3791條，下調基因3570條。其中差異倍數達10倍以上的基因43條，上調的基因有16條，下調的基因27條，其中AFP，HBA2，HBA1，HBD，LOC221136，SERPINA11，GLYAT

13、L1，PECR8個基因差異非常顯著，P＜10-7。差異表達基因以發(fā)育分化、信號轉導傳遞、細胞生理過程及調節(jié)基因為主，同時還涉及核酸轉錄翻譯、凋亡調節(jié)、細胞骨架、免疫應激、物質合成代謝及運輸等不同層次、不同功能的基因。
　　Real-time PCR技術對部分差異表達基因的驗證中發(fā)現，TGFβ1-BMP-Smad信號轉導通路中的關鍵基因CTGF、BMP7在BA患者肝臟組織中的表達水平明顯高于正常對照組。
　　2、TGFβ1-B

14、MP-Smad信號轉導通路中的關鍵調節(jié)蛋白及其編碼基因在膽道閉鎖動物模型中的表達的研究
　　感染RRV后發(fā)生BA的小鼠隨著時間的推移逐漸出現體重不增或下降，伴有食欲不振、無毛區(qū)肉眼可見的黃疸和小便變黃、陶土樣大便等癥狀。對照組無一例出現發(fā)育遲緩和膽汁淤積癥狀。取材時可見發(fā)生BA的小鼠肝臟顏色稍黃，部分肝緣呈鮮黃色壞死樣，表面顆粒狀，質韌，膽囊萎縮或膨大，肝外膽道呈條索狀狹窄，腎臟呈現深黃染。
　　HE染色顯示膽管狹窄或閉鎖，

15、膽管上皮細胞不規(guī)則增生，膽總管及周圍大量炎癥細胞浸潤，部分可見小膽管增生。肝外膽管免疫組織化學法檢測CTGF、BMP7，發(fā)現各實驗組均有CTGF及BMP7的陽性表達。Real-time PCR檢測CTGF、BMP7兩種基因在各組中的表達可見以上兩種基因在各組的表達均較相應對照組有明顯增高。
　　結論:
　　1、基因芯片篩查BA發(fā)生的相關基因，初步發(fā)現包括發(fā)育分化、信號轉導傳遞、細胞生理過程及調節(jié)、核酸轉錄翻譯、凋亡調節(jié)、物質

16、合成代謝及運輸等多種基因在膽道閉鎖肝臟組織中表達異常，這表明在BA的發(fā)生發(fā)展中有多種類型的基因參與。
　　2、初步篩查出差異表達基因差異倍數在2倍以上且P值＜0.05的基因有7361條，其中上調的基因有3791條，下調基因3570條。其中差異倍數達10倍以上的基因43條，上調的基因有16條，下調的基因27條，其中AFP，HBA2，HBA1，HBD，LOC221136，SERPINA11，GLYATL1，PECR8個基因差異非常顯著

17、，P＜10-7。
　　3、基因芯片結果中TGFβ1-BMP-Smad信號轉導通路中的關鍵基因CTGF、BMP7均為上調基因，經Real-time PCR驗證二者在BA患者肝臟組織中的表達水平明顯高于正常對照組，提示本研究中基因表達譜的實驗結果具有較好的可信度和可靠性。
　　4、Balb/c新生小鼠可在通過新生小鼠24h內注射MMU18006輪狀病毒制造膽道閉鎖動物模型
　　5、BA小鼠與同天數的對照組小鼠相比，體重均有