膽道閉鎖相關(guān)基因篩選及TGFβ1-BMP-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其發(fā)病中作用的研究.pdf

1、目的：
　　膽道閉鎖(biliary atresia，BA)是嬰兒期累及肝內(nèi)外膽管、最終導(dǎo)致終末期肝硬化的嚴(yán)重肝臟疾病，其特點為膽管進(jìn)行性的炎癥、纖維化，并最終消失[1-4]，即使在膽道重建術(shù)(Kasai術(shù))后大多數(shù)患兒的肝臟病變也將持續(xù)進(jìn)展，主要表現(xiàn)為逐漸加重的毛細(xì)膽管炎癥、纖維化、消失，最終約有80％的患者需肝移植（目前BA是兒童期肝移植的最常見原因，50％以上的兒童肝移植原發(fā)病變?yōu)槟懙篱]鎖[5,6]），Kasai術(shù)后10年靠

2、自體肝臟生存的另外約20％的患者仍有95％以上存在著進(jìn)行性的膽管損傷和不同程度的肝硬化[7]。因此對于膽道閉鎖的治療只停留于手術(shù)重建肝外膽道顯然是不夠的，成功的治療應(yīng)包括膽系纖維化進(jìn)程的終止、膠原纖維基質(zhì)的清除、正常肝臟結(jié)構(gòu)的恢復(fù)、膽管上皮細(xì)胞基因表達(dá)和代謝功能的恢復(fù)等，因而，預(yù)防、終止及逆轉(zhuǎn)膽管進(jìn)行性纖維化對于重塑肝內(nèi)膽管、有效引流膽汁、防止膽汁淤積性肝硬化，進(jìn)而達(dá)到根治至關(guān)重要，因而有必要探討新的治療靶點，以達(dá)到有效治療的目的。

3、r>　　基因芯片也稱為基因微陣列，是指在有限的載體上加載大量基因信號，可以用有限的標(biāo)本，在短時間內(nèi)、條件幾乎一致的情況下，檢測大量基因的表達(dá)情況，從而提供全面可靠的基因表達(dá)譜。目前基因芯片技術(shù)及生物信息學(xué)方法，以其高通量、高信息量等優(yōu)點，為研究分子與分子間復(fù)雜的相互作用提供了新的方法[8-10]。既往關(guān)于膽道閉鎖的研究以炎癥細(xì)胞或因子在發(fā)病中的作用為主，關(guān)于細(xì)胞之間及分子之間相互作用的研究較少。因此本研究借助基因芯片及生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)

4、現(xiàn)在基因組水平對基因表達(dá)譜及基因間的相互關(guān)系進(jìn)行研究，以期發(fā)現(xiàn)在膽道閉鎖發(fā)病過程中的關(guān)鍵信號通路，并對其主要基因表達(dá)、突變及相互作用的關(guān)系進(jìn)行探討。
　　最新的研究表明膽道閉鎖可能是一類病毒誘導(dǎo)的自身免疫性疾病，機(jī)體在致病因素的作用下對膽道特異性抗原產(chǎn)生了自身免疫損傷[13]。CTGF是TGF-β1重要的拮抗因子，與TGF-β1分享著某些共同的生物學(xué)功能，如促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)前膠原α1和纖維連接蛋白及整合素α5mRNA的表達(dá)

5、等，在EMT過程中，二者起協(xié)同作用，在致組織器官纖維化過程中，TGF-β1主要表達(dá)在纖維化的早期，而CTGF的持續(xù)表達(dá)則被認(rèn)為是纖維化病變緩慢進(jìn)展的重要因素[21,22]。體外實驗發(fā)現(xiàn)應(yīng)用CTGF的中和抗體可以阻斷TGF-β1引起的EMT瀑布效應(yīng)。而CTGF作為TGF-β1重要的下游效應(yīng)介質(zhì)，作用比較單一，僅在結(jié)締組織中表達(dá)，因而我們推測靶向性阻斷CTGF的表達(dá)可以干擾TGF-β1信號通路的激活，進(jìn)而阻斷EMT和纖維化進(jìn)程。如上所述，B

6、MP7是TGF-β1-BMP-Smad信號通路重要組成部分，通過與不同的受體結(jié)合在生物體內(nèi)發(fā)揮重要生理功能，BMP7可逆向調(diào)節(jié)TGF-β1引起的EMT。綜上所述，我們推測在膽管上皮細(xì)胞EMT啟動的關(guān)鍵時間點，通過合適的方式在TGF-β1-BMP-Smad信號通路的兩個重要環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)調(diào)節(jié)，必將影響膽管上皮細(xì)胞EMT的進(jìn)程，最終使纖維化終止或逆轉(zhuǎn)。
　　方法：
　　一、實驗材料
　　（一）、臨床組織標(biāo)本
　　收集近

7、三年來在我院治療并手術(shù)的膽道閉鎖病例13例，作為病例組。收集非消化系統(tǒng)疾病死亡尸檢患兒肝臟標(biāo)本3例，做為對照組。術(shù)中無菌取肝臟組織，放入無RNA酶的錫紙中，立即至于液氮中保存。
　?。ǘ?、實驗動物
　　體重18-22克的SPF級Balb/c小鼠25只（雄鼠:5只;雌鼠:20只）由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，按照雄雌比例1∶4分籠飼養(yǎng)，雌鼠孕后分籠單獨飼養(yǎng)，小鼠出生后隨機(jī)分為實驗組（49只）及對照組（52只）。
　　

8、二、實驗方法
　?。ㄒ唬┠懙篱]鎖和正常肝臟組織基因表達(dá)譜差異的研究
　　膽道閉鎖忠兒肝臟組織標(biāo)本3例;對照組由3例死于非消化系統(tǒng)疾病死亡尸檢患兒的肝臟標(biāo)本，術(shù)中無菌留取肝臟組織標(biāo)本。采用Trizol一步法提取組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，轉(zhuǎn)錄合成cRNA，合成的同時進(jìn)行生物素標(biāo)記。生物素標(biāo)記的cRNA探針經(jīng)片段化處理后與芯片雜交，掃描儀上掃描芯片。應(yīng)用GenePix Pro6.0 software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。將所獲探針

9、號于DAVID網(wǎng)站（http://david.abcc.ncifcrf.gov）中查詢出差異表達(dá)基因的生物學(xué)信息。根據(jù)差異倍數(shù)及P值篩選出最具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異表達(dá)基因8個（包括表達(dá)上調(diào)的基因:AFP，HBA2，HBA1，HBD，LOC221136及表達(dá)下調(diào)的基因:SERPINA11，GLYATL1，PECR)，根據(jù)各差異表達(dá)基因在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的內(nèi)在聯(lián)系及其在BA患者的肝膽纖維化過程中的作用篩選出TGFβ1-BMP-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通

10、路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因2個（包括TGF-β1的重要下游效應(yīng)介質(zhì)CTGF的同名編碼基因及TGF-β1的拮抗蛋白BMP7的同名編碼基因）。留取膽道閉鎖患兒肝臟組織標(biāo)本13例;死于非消化系統(tǒng)疾病患兒的肝臟組織標(biāo)本3例。應(yīng)用Real-time PCR的方法對TGFβ1-BMP-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因CTGF、BMP7進(jìn)行了研究，以驗證基因芯片的可靠性和可信度。
　　（二）TGFβ1-BMP-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵因子在膽道閉鎖

11、動物模型中的表達(dá)的研究
　　RRV病毒懸液對出生24h內(nèi)的Balb/c鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射，建立膽道閉鎖模型，對照組在相同時間內(nèi)注入等量生理鹽水。此后連續(xù)觀察小鼠體重、皮膚顏色和大小便顏色的變化。分別在1、3、5、7、10、15、20天取膽管及肝臟組織進(jìn)行石蠟包埋，連續(xù)切片行HE染色、免疫組織化學(xué)法及Western blot檢測TGFβ1-BMP-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白CTGF、BMP7的表達(dá)。Real-time PCR

12、檢測CTGF、BMP7兩種基因在各組中的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、膽道閉鎖和正常肝臟組織基因表達(dá)譜差異的研究
　　膽道閉鎖患兒肝臟組織與正常兒肝臟組織中表達(dá)差異在2倍以上且P值＜0.05的基因有7361條，其中上調(diào)的基因有3791條，下調(diào)基因3570條。其中差異倍數(shù)達(dá)10倍以上的基因43條，上調(diào)的基因有16條，下調(diào)的基因27條，其中AFP，HBA2，HBA1，HBD，LOC221136，SERPINA11，GLYAT

13、L1，PECR8個基因差異非常顯著，P＜10-7。差異表達(dá)基因以發(fā)育分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)傳遞、細(xì)胞生理過程及調(diào)節(jié)基因為主，同時還涉及核酸轉(zhuǎn)錄翻譯、凋亡調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架、免疫應(yīng)激、物質(zhì)合成代謝及運輸?shù)炔煌瑢哟?、不同功能的基因?br>　　Real-time PCR技術(shù)對部分差異表達(dá)基因的驗證中發(fā)現(xiàn)，TGFβ1-BMP-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵基因CTGF、BMP7在BA患者肝臟組織中的表達(dá)水平明顯高于正常對照組。
　　2、TGFβ1-B

14、MP-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白及其編碼基因在膽道閉鎖動物模型中的表達(dá)的研究
　　感染RRV后發(fā)生BA的小鼠隨著時間的推移逐漸出現(xiàn)體重不增或下降，伴有食欲不振、無毛區(qū)肉眼可見的黃疸和小便變黃、陶土樣大便等癥狀。對照組無一例出現(xiàn)發(fā)育遲緩和膽汁淤積癥狀。取材時可見發(fā)生BA的小鼠肝臟顏色稍黃，部分肝緣呈鮮黃色壞死樣，表面顆粒狀，質(zhì)韌，膽囊萎縮或膨大，肝外膽道呈條索狀狹窄，腎臟呈現(xiàn)深黃染。
　　HE染色顯示膽管狹窄或閉鎖，

15、膽管上皮細(xì)胞不規(guī)則增生，膽總管及周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤，部分可見小膽管增生。肝外膽管免疫組織化學(xué)法檢測CTGF、BMP7，發(fā)現(xiàn)各實驗組均有CTGF及BMP7的陽性表達(dá)。Real-time PCR檢測CTGF、BMP7兩種基因在各組中的表達(dá)可見以上兩種基因在各組的表達(dá)均較相應(yīng)對照組有明顯增高。
　　結(jié)論:
　　1、基因芯片篩查BA發(fā)生的相關(guān)基因，初步發(fā)現(xiàn)包括發(fā)育分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)傳遞、細(xì)胞生理過程及調(diào)節(jié)、核酸轉(zhuǎn)錄翻譯、凋亡調(diào)節(jié)、物質(zhì)

16、合成代謝及運輸?shù)榷喾N基因在膽道閉鎖肝臟組織中表達(dá)異常，這表明在BA的發(fā)生發(fā)展中有多種類型的基因參與。
　　2、初步篩查出差異表達(dá)基因差異倍數(shù)在2倍以上且P值＜0.05的基因有7361條，其中上調(diào)的基因有3791條，下調(diào)基因3570條。其中差異倍數(shù)達(dá)10倍以上的基因43條，上調(diào)的基因有16條，下調(diào)的基因27條，其中AFP，HBA2，HBA1，HBD，LOC221136，SERPINA11，GLYATL1，PECR8個基因差異非常顯著

17、，P＜10-7。
　　3、基因芯片結(jié)果中TGFβ1-BMP-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵基因CTGF、BMP7均為上調(diào)基因，經(jīng)Real-time PCR驗證二者在BA患者肝臟組織中的表達(dá)水平明顯高于正常對照組，提示本研究中基因表達(dá)譜的實驗結(jié)果具有較好的可信度和可靠性。
　　4、Balb/c新生小鼠可在通過新生小鼠24h內(nèi)注射MMU18006輪狀病毒制造膽道閉鎖動物模型
　　5、BA小鼠與同天數(shù)的對照組小鼠相比，體重均有