MicroRNA-145通過靶向調(diào)節(jié)IRS1及其下游Akt信號通路在肝細(xì)胞肝癌中的作用.pdf

1、背景：
　　肝細(xì)胞肝癌是世界上排名第五位的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)的第三大死亡原因。雖然導(dǎo)致肝癌的各種遺傳和表觀遺傳變化已經(jīng)闡明，肝癌相關(guān)的分子機制仍在逐步研究中。microRNA（miRNA）是一類高度保守的短的非編碼RNA，最近研究表明miRNA的表達(dá)異常在肝癌的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。其中，MicroRNA-145(miR-145)尤為突出，這是由于其參與多個腫瘤的發(fā)生機制。
　　目的:
　　研究miR-145對肝癌

2、細(xì)胞生長的作用，探討miR-145通過胰島素受體底物-1(IRS1)及其下游AKT信號通路的作用機制。
　　方法:
　　1.利用熒光定量PCR技術(shù)研究48對肝癌組織中miR-145和IRS1的表達(dá)情況，并統(tǒng)計分析兩者的相關(guān)性。
　　2.通過體外轉(zhuǎn)染mimic的方法呈現(xiàn)miR-145的過表達(dá)趨勢，在此基礎(chǔ)上，通過細(xì)胞活力分析實驗(CCK-8)、流式細(xì)胞術(shù)、平板克隆形成，研究miR-145對肝癌細(xì)胞增殖的影響。
　　

3、3.結(jié)合在d線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行miR-145靶基因預(yù)測和挑選，利用Westem Blot實驗和熒光素酶雙報告實驗進(jìn)行靶基因驗證。
　　4.通過體外轉(zhuǎn)染小干擾RNA(siRNA)的方法呈現(xiàn)IRS1的低表達(dá)趨勢，通過細(xì)胞活力分析實驗(CCK-8)、流式細(xì)胞術(shù)、平板克隆形成，研究IRS1對肝癌細(xì)胞增殖的影響。
　　5.利用Western Blot實驗檢測miR-145和IRS1對IRS1通路下游蛋白AKT,pAKT, FOXO1，pFO

4、XO1，和CyclinD1的表達(dá)水平的影響。
　　6.采用IGF1刺激已進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染miR-145 mimic的肝癌細(xì)胞進(jìn)行rescue實驗，通過檢測IRS1及其IRS1通路下游蛋白AKT, pAKT, FOXO1，pFOXO1，和CyclinD1的表達(dá)水平變化，驗證miR-145對IRS1下游AKT/FOXO1通路的作用。
　　結(jié)果:
　　1.在收集的48例肝癌標(biāo)本中，有34例為miR-145相對低表達(dá)，占70.8％

5、;有32例為IRS1相對高表達(dá)，占66.7％.兩者在肝癌組織中呈相反且相關(guān)的表達(dá)趨勢。
　　2.通過對Huh7和PLC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-145 mimic，來過表達(dá)細(xì)胞中的miR-145.我們觀察到miR-145可以抑制肝癌細(xì)胞增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G0/G1期周期阻滯，使細(xì)胞的集落生長能力和細(xì)胞活力降低降低。
　　3.通過信息軟件預(yù)測IRS1可能為miR-145的靶基因。熒光素酶雙報告系統(tǒng)和western結(jié)果表明，IRS1是

6、miR-145直接作用的靶點。對IRS1實施特異性沉默進(jìn)一步證實了其在miR-145調(diào)控細(xì)胞增殖能力中的作用，IRS1 siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株中CyclinD1、AKT、pAKT、FOXO1、pFOXO1的表達(dá)水平下降。
　　4.Western blot結(jié)果顯示miR-145轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株中CyclinD1、AKT、pAKT、FOXO1、pFOXO1的表達(dá)水平下降，而miR-145引起的AKT/FOXO1磷酸化和CyclinD1表達(dá)