miR-224對主動脈管壁力學性質的影響及其在夾層發(fā)生中的機制研究.pdf

1、研究目的:主動脈夾層(aortic dissection，AD)是嚴重威脅人類生命健康的一類心血管系統(tǒng)疾病，因其發(fā)病具有急、險、重的特點，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，受到了國內外研究者的重視，因此迫切需要對疾病更深入的研究和認識，然而其發(fā)病機制尚未完全闡明。本課題擬通過臨床樣本分析及動物實驗研究，以血管microRNA-224的異常表達與主動脈管壁的生物力學性質為著眼點，深入探討主動脈夾層發(fā)生發(fā)展的機制和干預策略，從基因與生物力學的層面為研

2、究主動脈夾層的發(fā)生發(fā)展和轉歸提供科學性的理論依據(jù)。同時，本研究將可能為主動脈夾層的早期診斷、預防和治療提供新的靶標和策略。
　　研究方法:通過生物信息學檢索發(fā)現(xiàn)miR-224對多種主動脈管壁力學相關基因、蛋白具有調控作用，篩選并確定以miR-224為研究靶標并進一步驗證其與主動脈管壁生物力學性質變化的關系。首先，在符合倫理學審查及患者知情同意前提下，采集正常捐獻者主動脈組織6例，胸主動脈夾層患者主動脈6例;對所有主動脈組織樣本按照

3、標準流程提取總RNA，采用實時熒光定量PCR技術檢測樣本中miR-224表達含量;而后將主動脈組織精細切割成長約15mm的啞鈴狀式樣，進行單軸力學拉伸測試，獲得應力應變曲線，極限應力，極限應變等力學指標，并比較miR-224表達含量與主動脈管壁力學性質變化的關系;為進一步驗證干預miR-224表達后主動脈管壁生物力學性質的變化情況，采用飲食中添加β-氨基丙腈及皮下植入血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)微泵的FVB小鼠建立

4、主動脈夾層模型，通過尾靜脈注射miR-224Agomir/antagomir15OD/只，分別設立空白對照組、普通造模組、miR-224上調表達組、miR-224上調對照組、miR-224下調表達組、miR-224下調對照組，研究miR-224對血管重構和主動脈管壁生物力學性質的影響;實驗結束處死小鼠，解剖分離小鼠主動脈，并在大體解剖層面觀察統(tǒng)計主動脈夾層病變發(fā)生情況，將小鼠主動脈分為4段，4％多聚甲醛固定石蠟包埋切片，HE染色測量小鼠

5、主動脈管壁厚度(Aortic wallthickness); EVG染色比較小鼠主動脈彈力纖維變化，Masson染色檢測小鼠主動脈膠原纖維變化;通過qRT-PCR檢測驗證干預miR-224后表達含量;免疫組織化學方法檢測力學相關蛋白Rho、ROCK1、SMAD表達變化;采用Electroforce5500動態(tài)力學試驗機對小鼠主動脈管壁進行單軸拉伸力學測試，記錄并比較應力(Stress)、應變(Strain)、極限應力（Failure S

6、tress）、極限應變(Failure Strain)、獲得應力應變曲線（stress-strain curve）計算彈性模量(Elastic modulus)及剛度(Stiffness)等力學參數(shù)，通過線性擬合分析不同應變條件下對應彈性模量的變化情況，計算應力-應變曲線下面積(AUC)，研究并明確干預miR-224對主動脈管壁力學性質變化的影響。
　　結果:臨床樣本研究，我們通過RT-PCR技術在胸主動脈夾層患者(n=6)與遺體

7、捐獻者（正常人）(n=6)樣本上進行差異表達檢測發(fā)現(xiàn)miR-224在主動脈夾層患者表達呈現(xiàn)顯著上調特征(P＜0.05)，分別對主動脈夾層患者及正常捐獻者主動脈進行單軸拉伸力學測試，結果表明，夾層組較正常組極限荷載，極限位移，極限應力、極限應變明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)初始彈性模量(Initial elasticmodule)夾層組較正常組顯著降低(P＜0.01)，極限彈性模量(Maxl elastic module)

8、兩組間無明顯差異(P＞0.05);動物實驗結果顯示:造模后主動脈夾層發(fā)生率分別為，空白對照組(n=0/11，0)、普通造模組(5/12，41.67％)、miR-224下調組(3/12，25％)、miR-224下調對照組(4/12，33.32％)、miR-224上調組(6/11，54.54％)、miR-224上調對照組(5/11，45.45％)，經統(tǒng)計分析，miR-224上調組小鼠主動脈夾層發(fā)生率較普通造模組顯著增高(6/11 vs5/1

9、2，P＜0.01) miR-224下調組小鼠主動脈夾層發(fā)生率較普通造模組顯著降低(3/12 vs5/12，P＜0.01);通過qRT-PCR驗證表明mir-224agomir可顯著促進小鼠主動脈miR-224的表達mir-224 antagomir可顯著抑制小鼠主動脈miR-224的表達(P＜0.05);對小鼠主動脈管壁進行力學測試結果顯示:較空白對照組，主動脈夾層造模組、miR-224上調、miR-224上調對照組、miR-224下調

10、組、miR-224下調對照組主動脈管壁厚度明顯增厚(P＜0.05)，上調組較下調組管壁平均厚度顯著增加(P＜0.05)，miR-224低表達較miR-224高表達能夠提高主動脈管壁的極限荷載、極限應力、初始彈性模量、極限彈性模量，應力-應變曲線下面積(AUC)平均值，但是極限位移、拉伸比管壁平均周長兩組間無明顯差異(P＞0.05); EVG染色分析提示上調miR-224較對照組使小鼠主動脈彈力纖維減少，結構紊亂，甚至斷裂，Masson染

11、色分析表明miR-224下調可增加小鼠主動脈彈力纖維及膠原纖維含量，這表明下調miR-224在夾層發(fā)生中具有保護性作用，而免疫組化結果提示小鼠主動脈組織中miR-224上調組較對照組其力學相關Rho、ROCK1、SMAD等信號表達明顯增強(P＜0.05)。
　　結論:我們首次探討了miR-224在主動脈夾層中表達的差異性同管壁生物力學性質之間的聯(lián)系，明確了其與夾層發(fā)生中的關系，并在此基礎上通過動態(tài)力學測試儀進行了人主動脈樣本生物力

12、學性質的檢測，RT-PCR驗證得出miR-224在主動脈夾層患者中呈高表達，同時我們測得人主動脈夾層患者的管壁力學各項指標如管壁厚度、初始彈性模量、極限應力、極限應變等較正常組織捐獻者明顯降低，提示miR-224高表達及主動脈管壁力學性質的差異與主動脈夾層形成關系密切。進一步的動物實驗結果表明，干預上調miR-224基因表達后小鼠主動脈夾層的發(fā)生率明顯增高，而下調miR-224表達后夾層發(fā)生率明顯降低，并且提示miR-224為主動脈夾層