Stanford A型主動脈夾層管壁生物力學及彈力纖維相關(guān)蛋白表達情況的研究.pdf

1、StanfordA型胸主動脈夾層(Thoracic Aortic Dissection，TAD)系主動脈血流經(jīng)內(nèi)膜破口沿管壁中層剝離，病變累及升主動脈以及主動脈弓部，并可累及全主動脈。從生物力學的觀點看來，StanfordA型TAD的發(fā)生系主動脈管壁所承受的管腔內(nèi)血流沖擊應力超過了其機械強度的極限所致。雖然臨床上常以TAD患者發(fā)生夾層處主動脈的管腔最大直徑作為粗略估計其破裂可能的一項指標，但對TAD患者管壁各層的生物力學性質(zhì)做更為精確的

2、定量分析對于臨床上更好地判斷患者預后是很有必要的。然而，目前人體主動脈的力學研究數(shù)量仍很少，并多以腹主動脈瘤(Abdominalaorticaneurysm，AAA)或升主動脈真性動脈瘤為研究對象。由于動物實驗表明主動脈管壁由近端至遠端不同節(jié)段的力學性質(zhì)有較大差異，且TAD的病理生理過程和真性ATAA并不相同，因此StanfordA型TAD患者升主動脈管壁各層的力學性質(zhì)目前尚未明確。
　　 彈性纖維(Elasticfibers，

3、EF)是主動脈這類彈力型動脈細胞外基質(zhì)(ExtracellularMatrix，ECM)的最主要成分之一，占其干重的30％。既往研究表明EF和膠原纖維在主動脈的含量和相對比例是決定管壁力學特性的最主要因素。EF是與決定管壁極限應力(FailureStress)的主要因素“膠原纖維”相對應的一類ECM，其賦予了主動脈良好的可擴張性和回坐力，決定了其順應性和極限應變(FailureStrain)能力。管壁中層彈力片層(elasticlame

4、llae)結(jié)構(gòu)的毀損和缺失是公認的StanfordA型TAD特征性病理改變之一，因此，明確TAD發(fā)病后不同時期管壁EF的重構(gòu)情況對進一步探究其力學性質(zhì)變化的潛在分子基礎(chǔ)具有重要意義，并可為篩選藥物保守A型夾層的潛在分子生物學靶點提供參考。然而，既往有關(guān)ECM及EF在TAD中的研究多從膠原/彈性蛋白酶及炎性反應對ECM降解的角度展開，有關(guān)EF合成在TAD病理過程中作用的研究甚少。主動脈管壁具有生物力學功能的成熟EF的合成是一個由多種分子參

5、與，多步驟逐級調(diào)控的復雜過程。目前有關(guān)主動脈疾病中與EF的合成異常相關(guān)的研究多以AAA為研究對象，然而，由于主動脈由近心端向遠端彈性/膠原纖維比例逐漸減低，且TAD的發(fā)病機制不同于TAA，因此在TAD病例中，升主動脈管壁EF的合成是否具有異常，并由此導致了力學性質(zhì)的變化，目前尚未明確合成的具體情況以及由此導致的力學性質(zhì)的改變目前尚未明確。
　　 綜上所述，我們在本課題中旨在通過：1、通過力學試驗明確StanfordA型TAD患者

6、升主動脈管壁力學特性的變化情況，特殊染色明確A型夾層患者升主動脈管壁形態(tài)及成熟彈性纖維含量。2、通過分子生物學實驗技術(shù)手段明確StanfordA型TAD發(fā)病后，升主動脈管壁各層組織中彈性纖維相關(guān)分子(Elastic-fibre-associatedmolecules，EFAM)的表達重構(gòu)情況，為探究TAD管壁力學特性改變的潛在分子基礎(chǔ)提供相關(guān)信息。
　　 第一部分，StanfordA型TAD升主動脈力學試驗及管壁成熟彈性纖維的形

7、態(tài)學研究
　　 目的：1、明確StanfordA型TAD患者和正常人相比其升主動脈管壁力學特性的變化情況。2、明確TAD患者較之對照組升主動脈管壁成熟彈性纖維的密度及分布情況。
　　 方法：1、通過單軸拉伸試驗實時記錄應變.應力曲線(Strain-stresscurve)，并根據(jù)獲得的高頻數(shù)據(jù)計算彈性模量-應力曲線(Elasticmodulous-stresscurve)，由此獲得正常對照組及StanfordA型急、慢性

8、TAD患者升主動脈管壁內(nèi)中層、外膜及全層組織拉伸至毀損時的極限阿爾曼西應變(FailureAlmansistrain，ef)、極限柯西應力(FailureCauchystress，sf)、以及極限彈性模量(PeakElasticModulus，Mp)，并進行相應統(tǒng)計分析對比組間差異。2、通過直線回歸分析sf和Mp之間的相關(guān)性，計算相關(guān)系數(shù)。3、經(jīng)HE及VG染色明確各組標本升主動脈管壁彈性、膠原纖維在各層的分布情況。
　　 結(jié)果：

9、1、急、慢性TAD患者管壁各層的ef在周向(Circumferential，CIRC)及縱向(Longitudinal，Long)均顯著低于對照組，而急、慢性TAD相比管壁各層在周、縱向ef均無顯著差異。2、急、慢性TAD患者單純分離的管壁內(nèi)中層或外膜組織在周、縱向的sf均顯著低于對照組。急、慢性TAD相比內(nèi)膜組織的sf在周、縱向均無顯著差異；而外膜顯示慢性TAD組的sf在周、縱向均顯著高于急性TAD。對于管壁全層組織，sf在周、縱向均

10、顯示僅急性TAD顯著低于對照組，而慢性TAD與對照組無顯著差異。3、彈性模量方面，分離的內(nèi)中層及外膜組織在周、縱向的Mp測試結(jié)果顯示：急、慢性TAD組均顯著低于對照組，而急、慢性TAD相比內(nèi)膜的Mp無顯著差異，外膜Mp則慢性組顯著高于急性組。對于全層組織，僅急性TAD患者的Mp低于對照組，慢性TAD與對照組相比無統(tǒng)計學差異，并顯著高于急性TAD。4、各組人群內(nèi)中層和外膜組織力學差異的研究顯示，正常人和TAD患者升主動脈外膜組織的ef、s

11、f、Mp在周、縱向上均顯著高于各自的內(nèi)膜組織。各組的管壁力學特性在周、縱向上的差異性研究提示ef在這兩個方向無顯著差異，而sf和Mp則顯示周向顯著高于縱向。5、直線回歸分析顯示各組人群的各層組織其sf和Mp在周向及縱向均呈高度正相關(guān)性。6、形態(tài)學研究顯示TAD患者管壁特征性的彈性纖維結(jié)構(gòu)毀損，其含量顯著低于正常主動脈。
　　 結(jié)論：1、TAD患者升主動脈的極限擴張力顯著低于正常主動脈，且急、慢性TAD相比，各層組織在周、縱向的可

12、擴張性均無顯著差異。2、StanfordA型夾層主動脈管壁的力學強度顯著低于正常對照，但慢性TAD在管壁力學強度上有一定程度的代償，主要表現(xiàn)為外膜組織機械強度增加。3、外膜不論在TAD患者還是正常人，其相對于內(nèi)中層組織均是一可拉伸性能更好，且力學強度更大的結(jié)締組織。4、升主動脈在周向的機械強度要顯著大于縱向，但二者的可拉伸性能無顯著差異，提示升主動脈管壁在不同方向的力學特性存在一定差異。5、組織學顯示TAD患者管壁EF毀損嚴重，含量較正

13、常升主動脈減少。
　　 第二部分，StanfordA型TAD升主動脈管壁彈力纖維相關(guān)蛋白表達情況的研究
　　 目的：明確StanfordA型TAD發(fā)病后，升主動脈管壁各層組織EFAM的表達情況，為探究導致TAD升主動脈管壁力學性質(zhì)變化的潛在ECM分子機制提供相關(guān)信息。
　　 方法：1、通過普通RT-PCR及實時定量RT-PCR明確各組人群升主動脈管壁各層組織中彈性蛋白原(Tropoelastin，TE)、微纖維相

14、關(guān)蛋白以及賴氨酰氧化酶同工酶-1(Lysyloxidaselike-1，Loxl-1)mRNA的表達含量。2、通過免疫組織化學染色行形態(tài)學研究明確上述EFAM分子對應的蛋白在升主動脈管壁的分布定位情況。3、通過蛋白印跡(Westernblot)定量分析上述EFAM在正常人和TAD患者升主動脈管壁各層的表達情況。
　　 結(jié)果：1、急、慢性TAD組管壁各層可溶性TE的mRNA及對應蛋白均較對照組有顯著增加，且均以外膜增加更為顯著。急

15、、慢性TAD相比，急性TAD患者的TEmRNA含量更多，而在蛋白水平二組人群無顯著差異。2、急、慢性TAD患者管壁全層組織原纖維類分子在mRNA及蛋白水平的含量均不高于正常對照組。對于單純內(nèi)中層組織，TAD患者較之對照組此類蛋白表達亦無顯著增加。對于單純外膜組織，急、慢性TAD組Emilin-1，F(xiàn)ibulin-4、5以及MAGP-1的含量顯著高于對照組。3、成纖維細胞的標記分子DDR-2染色顯示急、慢性TAD患者管壁各層陽性染色均高于

16、正常對照，并在外膜增加更為明顯。4、急、慢性TAD患者管壁各層中促進TE交聯(lián)和EF成熟的關(guān)鍵酶Loxl-1的mRNA及蛋白含量均顯著低于對照組，且慢性TAD和急性組相比顯示了更低的表達含量。
　　 結(jié)論：TAD發(fā)病后，管壁彈性纖維相關(guān)蛋白的表達主要位于外膜，而內(nèi)中層組織則未表現(xiàn)出較為活躍的表達。從表達成份來看，參與成熟彈力纖維組裝的可溶性EFAM在TAD組呈現(xiàn)不平衡表達的情況，具體表現(xiàn)為無定形核心的主要成分TE較正常主動脈表達增