原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥的外周血白細胞microRNA表達譜多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病1型相關(guān)的甲狀旁腺腫瘤p27Kip1及β-連環(huán)蛋白的表達.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥的外周血白細胞microRNA表達譜
　　背景：原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥(primary hyperparathyroidism，PHPT)是因甲狀旁腺本身病變導(dǎo)致分泌過量甲狀旁腺素的全身性疾病，病理類型多為良性的腺瘤(parathyroid adenoma，PA)，少數(shù)為增生及惡性的腺癌(parathyroid carcinoma，PC)。PC患者術(shù)后

2、復(fù)發(fā)及死亡率高，然而術(shù)前鑒別PA及PC仍十分困難。多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病1型(multiple endocrine neoplasia type1，MEN1)是最常見的遺傳性PHPT。microRNA(miRNA)是一類單鏈非編碼小分子RNA，對基因進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。外周血白細胞miRNA可作為分子標志物指導(dǎo)病理分型、預(yù)后等。
　　目的：1.尋找與散發(fā)性PA、PC以及MEN1相關(guān)的PHPT(MEN1related PHPT，MHPT)發(fā)

3、病相關(guān)的外周血白細胞miRNAs。
　　2.尋找有助于術(shù)前鑒別PC與PA的外周血白細胞miRNAs分子標志物。
　　方法：1.研究對象：北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科確診的22例散發(fā)性PA、14例散發(fā)性PC及16例MHPT患者。年齡、性別與PA組匹配的23例正常對照(normal control，NC)。
　　2.研究方法：(1)遺傳分析：提取研究對象的外周血細胞總RNA和總DNA。應(yīng)用Sanger測序?qū)ιl(fā)性PHPT患者進行M

4、EN1基因、CDC73基因、CaSR基因、CDKN1B基因以及RET基因突變分析，排除遺傳性PHPT。篩查MHPT患者的MEN1基因突變。(2)miRNA表達譜分析：應(yīng)用Affymetrix miRNA4.0芯片（含2578個人成熟miRNA）分析各組中性別、年齡相匹配的6例對象的外周血白細胞miRNA表達譜，得到組間差異miRNAs（P＜0.05，差異倍數(shù)＞1.5或＜-1.5）。使用GCBI平臺進行生物信息學(xué)分析。(3)結(jié)果驗證：應(yīng)用

5、實時定量PCR(quantitative real time PCR，qRT-PCR)在22例PA、14例PC、16例MHPT患者以及23例NC中驗證候選miRNAs的表達水平。
　　結(jié)果：1.PA組與NC組相比：①芯片：共有45個差異表達的miRNAs(同時滿足Q＜0.05)，差異倍數(shù)在-3.259～2.818之間。②qRT-PCR驗證：挑選14個miRNAs進行驗證，PA組let-7e-5p、let-7f-5p及has-miR

6、-1260b的表達水平顯著升高，分別為NC組的3.01倍(P=0.028)、2.60倍(P=0.031)及1.98倍(P=0.043);miR-98-5p的表達在PA組呈上調(diào)趨勢，為NC組的2.49倍(P=0.068)。
　　2.PC組與NC組相比：①芯片：共有37個差異表達的miRNAs，差異倍數(shù)在-3.309～2447之間。②qRT-PCR驗證：挑選10個miRNAs進行驗證，PC組的miR-4646-5p、miR-5196-

7、5p及miR-6757-5p的表達分別是NC組的1.73(P=0.035)倍、1.84倍(P=0.033)及1.58倍(P=0.017)。
　　3.PC組與PA組相比：①芯片：共有64個差異表達的miRNAs，差異倍數(shù)在-2.421～2.498之間。②qRT-PCR驗證：挑選15個miRNAs進行驗證，校正性別后，miR-3136-3p及miR-5088-5p的表達在PC組呈上調(diào)趨勢（P=0.070及0.076）。通過二元Logi

8、stic回歸將性別分別與上述兩個miRNAs進行建模，得到的新變量PRE_1及PRE_2有助于術(shù)前鑒別PC與PA（曲線下面積：0.776，0.805）。
　　4.MHPT組與NC組相比：①遺傳分析：MHPT組中有10例攜帶MEN1基因突變。②芯片：共有30個差異表達的miRNAs，差異倍數(shù)在-2.614～2.244之間。③qRT-PCR驗證：挑選7個miRNAs進行驗證，MHPT組miR-1268b及miR-5194的表達水平顯著

9、低于NC組，分別為NC組的38.85％(P=0.001)及56.63％(P=0.004)。
　　結(jié)論：本研究首次探討了PHPT的外周血白細胞的miRNA表達譜。與正常對照相比，PA組的let-7e-5p、let-7f-5p及has-miR-1260b的表達顯著升高，PC組的miR-4646-5p、miR-5196-5p及miR-6757-5p的表達顯著升高，MHPT組的miR-1268b及miR-5194的表達顯著降低。這些異常表

10、達的miRNAs可能有助于未來深入研究PHPT的發(fā)生、發(fā)展機制。miR-3136-3p及miR-5088-5p有望成為術(shù)前鑒別良惡性甲狀旁腺腫瘤的分子標志物之一，但需要更大的樣本量研究進行驗證。
　　第二部分 多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病1型相關(guān)的甲狀旁腺腫瘤p27Kip1及β-連環(huán)蛋白的表達
　　目的：分析p27Kip1及β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病1型(multiple endocrine neoplas

11、ia type 1，MEN1)相關(guān)的原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥(primary hyperparathyroidism，PHPT)腫瘤組織中的表達，以探索其在MEN1相關(guān)的甲狀旁腺腫瘤發(fā)病機制中的作用。
　　方法：收集2002年至2013年北京協(xié)和醫(yī)院收治的31例MEN1相關(guān)的PHPT (MEN1 related PHPT，MHPT)患者的31份甲狀旁腺腫瘤組織以及5份正常甲狀旁腺(normal parathyroid，NP)組織的

12、石蠟標本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測p27Kip1及β-catenin蛋白的表達情況。
　　結(jié)果：MHPT腫瘤組織中，p27Kip1在細胞核表達為缺失、弱陽性或中等陽性（比例分別為12.9％、32.3％、54.8％）;細胞膜β-catenin表達為強陽性或中等陽性、細胞質(zhì)β-catenin表達為中等陽性或弱陽性，未見有β-catenin表達于細胞核。MHPT組織p27Kip1表達水平顯著低于NP組織(P=0.001)，但細胞膜及細