原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥的外周血白細(xì)胞microRNA表達(dá)譜多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病1型相關(guān)的甲狀旁腺腫瘤p27Kip1及β-連環(huán)蛋白的表達(dá).pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥的外周血白細(xì)胞microRNA表達(dá)譜
　　背景：原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥(primary hyperparathyroidism，PHPT)是因甲狀旁腺本身病變導(dǎo)致分泌過(guò)量甲狀旁腺素的全身性疾病，病理類型多為良性的腺瘤(parathyroid adenoma，PA)，少數(shù)為增生及惡性的腺癌(parathyroid carcinoma，PC)。PC患者術(shù)后

2、復(fù)發(fā)及死亡率高，然而術(shù)前鑒別PA及PC仍十分困難。多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病1型(multiple endocrine neoplasia type1，MEN1)是最常見的遺傳性PHPT。microRNA(miRNA)是一類單鏈非編碼小分子RNA，對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。外周血白細(xì)胞miRNA可作為分子標(biāo)志物指導(dǎo)病理分型、預(yù)后等。
　　目的：1.尋找與散發(fā)性PA、PC以及MEN1相關(guān)的PHPT(MEN1related PHPT，MHPT)發(fā)

3、病相關(guān)的外周血白細(xì)胞miRNAs。
　　2.尋找有助于術(shù)前鑒別PC與PA的外周血白細(xì)胞miRNAs分子標(biāo)志物。
　　方法：1.研究對(duì)象：北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科確診的22例散發(fā)性PA、14例散發(fā)性PC及16例MHPT患者。年齡、性別與PA組匹配的23例正常對(duì)照(normal control，NC)。
　　2.研究方法：(1)遺傳分析：提取研究對(duì)象的外周血細(xì)胞總RNA和總DNA。應(yīng)用Sanger測(cè)序?qū)ιl(fā)性PHPT患者進(jìn)行M

4、EN1基因、CDC73基因、CaSR基因、CDKN1B基因以及RET基因突變分析，排除遺傳性PHPT。篩查MHPT患者的MEN1基因突變。(2)miRNA表達(dá)譜分析：應(yīng)用Affymetrix miRNA4.0芯片（含2578個(gè)人成熟miRNA）分析各組中性別、年齡相匹配的6例對(duì)象的外周血白細(xì)胞miRNA表達(dá)譜，得到組間差異miRNAs（P＜0.05，差異倍數(shù)＞1.5或＜-1.5）。使用GCBI平臺(tái)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。(3)結(jié)果驗(yàn)證：應(yīng)用

5、實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real time PCR，qRT-PCR)在22例PA、14例PC、16例MHPT患者以及23例NC中驗(yàn)證候選miRNAs的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.PA組與NC組相比：①芯片：共有45個(gè)差異表達(dá)的miRNAs(同時(shí)滿足Q＜0.05)，差異倍數(shù)在-3.259～2.818之間。②qRT-PCR驗(yàn)證：挑選14個(gè)miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，PA組let-7e-5p、let-7f-5p及has-miR

6、-1260b的表達(dá)水平顯著升高，分別為NC組的3.01倍(P=0.028)、2.60倍(P=0.031)及1.98倍(P=0.043);miR-98-5p的表達(dá)在PA組呈上調(diào)趨勢(shì)，為NC組的2.49倍(P=0.068)。
　　2.PC組與NC組相比：①芯片：共有37個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，差異倍數(shù)在-3.309～2447之間。②qRT-PCR驗(yàn)證：挑選10個(gè)miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，PC組的miR-4646-5p、miR-5196-

7、5p及miR-6757-5p的表達(dá)分別是NC組的1.73(P=0.035)倍、1.84倍(P=0.033)及1.58倍(P=0.017)。
　　3.PC組與PA組相比：①芯片：共有64個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，差異倍數(shù)在-2.421～2.498之間。②qRT-PCR驗(yàn)證：挑選15個(gè)miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，校正性別后，miR-3136-3p及miR-5088-5p的表達(dá)在PC組呈上調(diào)趨勢(shì)（P=0.070及0.076）。通過(guò)二元Logi

8、stic回歸將性別分別與上述兩個(gè)miRNAs進(jìn)行建模，得到的新變量PRE_1及PRE_2有助于術(shù)前鑒別PC與PA（曲線下面積：0.776，0.805）。
　　4.MHPT組與NC組相比：①遺傳分析：MHPT組中有10例攜帶MEN1基因突變。②芯片：共有30個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，差異倍數(shù)在-2.614～2.244之間。③qRT-PCR驗(yàn)證：挑選7個(gè)miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，MHPT組miR-1268b及miR-5194的表達(dá)水平顯著

9、低于NC組，分別為NC組的38.85％(P=0.001)及56.63％(P=0.004)。
　　結(jié)論：本研究首次探討了PHPT的外周血白細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜。與正常對(duì)照相比，PA組的let-7e-5p、let-7f-5p及has-miR-1260b的表達(dá)顯著升高，PC組的miR-4646-5p、miR-5196-5p及miR-6757-5p的表達(dá)顯著升高，MHPT組的miR-1268b及miR-5194的表達(dá)顯著降低。這些異常表

10、達(dá)的miRNAs可能有助于未來(lái)深入研究PHPT的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。miR-3136-3p及miR-5088-5p有望成為術(shù)前鑒別良惡性甲狀旁腺腫瘤的分子標(biāo)志物之一，但需要更大的樣本量研究進(jìn)行驗(yàn)證。
　　第二部分 多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病1型相關(guān)的甲狀旁腺腫瘤p27Kip1及β-連環(huán)蛋白的表達(dá)
　　目的：分析p27Kip1及β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病1型(multiple endocrine neoplas

11、ia type 1，MEN1)相關(guān)的原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥(primary hyperparathyroidism，PHPT)腫瘤組織中的表達(dá)，以探索其在MEN1相關(guān)的甲狀旁腺腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法：收集2002年至2013年北京協(xié)和醫(yī)院收治的31例MEN1相關(guān)的PHPT (MEN1 related PHPT，MHPT)患者的31份甲狀旁腺腫瘤組織以及5份正常甲狀旁腺(normal parathyroid，NP)組織的

12、石蠟標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)p27Kip1及β-catenin蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：MHPT腫瘤組織中，p27Kip1在細(xì)胞核表達(dá)為缺失、弱陽(yáng)性或中等陽(yáng)性（比例分別為12.9％、32.3％、54.8％）;細(xì)胞膜β-catenin表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性或中等陽(yáng)性、細(xì)胞質(zhì)β-catenin表達(dá)為中等陽(yáng)性或弱陽(yáng)性，未見有β-catenin表達(dá)于細(xì)胞核。MHPT組織p27Kip1表達(dá)水平顯著低于NP組織(P=0.001)，但細(xì)胞膜及細(xì)