阿利吉侖對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠的腦保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、缺血性腦血管病是臨床常見病、多發(fā)病之一，具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率、恢復(fù)緩慢的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給患者家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)，且近年來逐漸有年輕化的趨勢(shì)。在腦缺血發(fā)生時(shí)，未接受溶栓治療者腦組織中的動(dòng)脈栓子自發(fā)向遠(yuǎn)端推移出現(xiàn)血管再通有可能引發(fā)缺血部位過度再灌注;而接受溶栓治療的患者血管再通雖可達(dá)到部分有效再灌注，但由于缺血腦組織微血管結(jié)構(gòu)完整性與功能出現(xiàn)損傷，血腦屏障破壞、自身調(diào)節(jié)衰竭，而可能發(fā)生瀑布式神經(jīng)損

2、傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致缺血再灌注損傷。研究證實(shí)腦缺血再灌注損傷是導(dǎo)致患者病情加重的主要原因，因此，腦缺血后如何減輕神經(jīng)細(xì)胞再灌注損傷及死亡是臨床面臨的重要課題。
　　 近年來隨著現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，對(duì)于腦缺血再灌注損傷病理生理機(jī)制研究已取得了重大進(jìn)步，目前普遍認(rèn)為其病理生理機(jī)制主要包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基損傷等，這幾種因素并不是孤立存在的，彼此之間相互作用、相互影響，構(gòu)成了

3、一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，造成一系列病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，直接或者間接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡/死亡，導(dǎo)致神經(jīng)功能缺失。在腦缺血后復(fù)雜的病理損傷機(jī)制中，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡是目前神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)，是腦缺血再灌注損傷的主要原因，抗氧化應(yīng)激、減輕炎癥損傷、抗細(xì)胞凋亡成為治療缺血性腦血管病的主要途徑之一。
　　 盡管已經(jīng)有多種藥物經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究，證明具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，但多數(shù)未能在臨床得到廣泛應(yīng)用，使理論和實(shí)踐大大脫節(jié)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象最主

4、要的原因是動(dòng)物與人類生理機(jī)制及耐受性等方面的差異以及腦缺血后級(jí)聯(lián)反應(yīng)的復(fù)雜性，單一使用阻斷某一病理環(huán)節(jié)的藥物可能難以奏效。所以在目前的臨床治療中，理想的神經(jīng)保護(hù)劑應(yīng)該具備針對(duì)缺血再灌注損傷多個(gè)損傷環(huán)節(jié)發(fā)揮保護(hù)作用的特性。
　　 阿利吉侖(Aliskiren)是近年來合成的第一個(gè)口服、非肽類、直接腎素抑制劑，相對(duì)分子量為609.8。近年來，動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阿利吉侖具有廣泛的生理作用，不僅能夠有效降低高血壓、抑制心肌纖維化和保護(hù)

5、靶器官，還具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，抗炎等作用。但是阿利吉侖是否可以起到腦保護(hù)作用，其作用機(jī)制如何均有待探索。
　　 臨床上缺血性腦血管疾病多為局灶性，部分患者由于溶栓治療或栓子自發(fā)向遠(yuǎn)端推移出現(xiàn)血管再通出現(xiàn)再灌注現(xiàn)象，因此，制備局灶性腦梗死并且可實(shí)現(xiàn)再灌注的動(dòng)物模型更為接近臨床實(shí)際情況。本研究選用雄性C57/BL小鼠為研究對(duì)象，采用改良Longa線栓法建立腦缺血再灌注模型，在大腦中動(dòng)脈阻塞所致的腦缺血再灌注模型上觀察腦缺血后H

6、MGB1，TLR4，NF-κB，ERK1/2，HO-1，PI3K，AKT，Bcl-2和Bax的表達(dá)，確定缺血后與炎癥反應(yīng)、氧化損傷及凋亡的關(guān)系，并選用阿利吉侖進(jìn)行干預(yù)，評(píng)價(jià)干預(yù)前后梗死體積、腦含水量、神經(jīng)功能缺損評(píng)分，以及阿利吉侖對(duì)HMGB1，TLR4，NF-κB，ERK1/2，PI3K，AKT，Bcl-2和Bax信號(hào)通路的作用，初步探討其在缺血再灌注損傷后的腦保護(hù)作用機(jī)制，并應(yīng)用ERK特異性拮抗劑PD98059和PI3K特異性拮抗劑L

7、Y294002進(jìn)行干預(yù)，觀察上述各因子的變化，以及評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺失、腦水腫和梗死體積情況。本研究分三部分，現(xiàn)將各部分內(nèi)容概述如下。
　　 第一部分:阿利吉侖對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠的抗炎作用及其相關(guān)機(jī)制研究
　　 目的:觀察腦缺血再灌注損傷后HMGB1/TLR4/NF-κB的變化，研究阿利吉侖對(duì)腦缺血再灌注損傷所致的炎癥反應(yīng)的作用，探討阿利吉侖抗炎相關(guān)作用機(jī)制。
　　 方法:選用成年雄性C57/BL小鼠為研究

8、對(duì)象，應(yīng)用改良線栓法制備大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。隨機(jī)將C57/BL小鼠分為4組:假手術(shù)組(Sham)，溶劑對(duì)照組（Verhicle），阿利吉侖低劑量組(L-AS)，阿利吉侖高劑量組(H-AS)。Sham組:假手術(shù)前連續(xù)5天以灌胃方式給予等量生理鹽水，每日一次;Vehicle組:術(shù)前連續(xù)5天以灌胃方式給予等量生理鹽水，每日一次;小劑量阿利吉侖干預(yù)組(L-AS):術(shù)前連續(xù)5天以灌胃方式給予阿利吉侖10mg/Kg，每日一次;大劑量阿利吉侖干

9、預(yù)組(H-AS):術(shù)前連續(xù)5天以灌胃方式給予阿利吉侖25mg/Kg，每日一次。各組取材前進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，干濕重法測(cè)定腦組織含水量，TTC染色評(píng)價(jià)腦梗死體積，分別用免疫組化，Western-blot和RT-qPCR的方法檢測(cè)缺血腦組織中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白和mRNA水平的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.Sham組中未見小鼠神經(jīng)功能缺損，神經(jīng)功能缺失評(píng)分為0分;Vehicle組在24h和72h神經(jīng)功能缺損評(píng)

10、分均較嚴(yán)重，L-AS組在24h和72h與Vehicle組相比可降低神經(jīng)功能缺損，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，H-AS組在24h和72h與Vehicle組相比可明顯降低神經(jīng)功能缺損，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　 2.與Vehicle組相比，L-AS組在24h和72h可降低腦含水量，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，H-AS組在24h和72h與Vehicle組相比可明顯降低腦含水量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.

11、05）;
　　 3.與Vehicle組相比，L-AS組在24h和72h可減小腦梗死體積，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，H-AS組在24h和72h與Vehicle組相比可明顯降低腦梗死體積，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.缺血后24h和72h，HMGB1、TLR4及NF-κB的表達(dá)均有升高。兩種劑量阿利吉侖干預(yù)后均可以降低腦缺血再灌注小鼠腦組織中的炎癥反應(yīng)。免疫組化結(jié)果顯示，與Vehicle組相比，H

12、-AS組在24h和72h均可明顯降低HMGB1、TLR4及NF-κB的陽性細(xì)胞數(shù)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);L-AS組在24h和72h可降低HMGB1、TLR4及NF-κB的陽性細(xì)胞數(shù)，但是無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 5.Westernblot結(jié)果顯示，與Vehicle組相比，H-AS在24h和72h可明顯降低胞漿HMGB1、TLR4及胞核NF-KB的蛋白表達(dá)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);L-AS組在24h和

13、72h可降低胞漿HMGB1、TLR4及胞核NF-κB，但無統(tǒng)計(jì)差異學(xué)（P＞0.05）。
　　 6.與免疫組化和Westernblot結(jié)果一致，H-AS在24h和72h可明顯降低TLR4及NF-κB的mRNA表達(dá)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);L-AS組在24h和72h可降低胞漿TLR4及NF-κB在mRNA水平的表達(dá)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。而HMGB1在基因表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:阿利吉侖對(duì)缺血

14、再灌注小鼠有較好的神經(jīng)保護(hù)作用，可改善腦缺血損傷后的神經(jīng)功能缺失，減輕腦水腫，減小腦梗死體積，同時(shí)缺血再灌注損傷后的腦組織的HMGB1、TLR4及NF-κB的表達(dá)變化與腦組織損傷程度一致，提示腦缺血再灌注后HMGB1/NF-KB通路參與了缺血后損傷;阿利吉侖可下調(diào)TLR4表達(dá)、抑制HMGB1、NF-κB的轉(zhuǎn)位，從而減輕缺血后的過度炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 第二部分:阿利吉侖對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠的抗氧化作

15、用及其相關(guān)機(jī)制研究
　　 目的:觀察腦缺血再灌注損傷后ERK/HO-1通路的表達(dá)變化以及SOD活性和MDA含量的變化，研究阿利吉侖對(duì)腦缺血再灌注損傷所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，探討阿利吉侖抗氧化作用的相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:選用成年雄性C57/BL小鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用改良線栓法制備大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。隨機(jī)將C57/BL小鼠分為5組:假手術(shù)組(Sham)，溶劑對(duì)照組(Verhicle)，阿利吉侖低劑量組(L-AS)，阿

16、利吉侖高劑量組(H-AS)，阿利吉侖+PD98059組(AS+PD98059)。Sham組:假手術(shù)前連續(xù)5天以灌胃方式給予等量生理鹽水，每日一次;Vehicle組:術(shù)前連續(xù)5天以灌胃方式給予等量生理鹽水，每日一次;小劑量阿利吉侖干預(yù)組(L-AS):術(shù)前連續(xù)5天以灌胃方式給予阿利吉侖10mg/Kg，每日一次;大劑量阿利吉侖干預(yù)組(H-AS):術(shù)前連續(xù)5天以灌胃方式給予阿利吉侖25mg/Kg，每日一次;阿利吉侖+PD98059組(AS+PD

17、98059):術(shù)前連續(xù)5天以灌胃方式給予阿利吉侖25mg/Kg，每日一次，術(shù)后立即腹腔注射50mg/kgPD98059。各組取材前進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，干濕重法測(cè)定腦組織含水量，TTC染色評(píng)價(jià)腦梗死體積，檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)的活性，丙二醛(MDA)含量的變化情況，分別用免疫組化，Westem-blot和RT-qPCR的方法檢測(cè)缺血腦組織中ERK、HO-1蛋白和mRNA水平的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.Sham組中

18、未見小鼠神經(jīng)功能缺損，神經(jīng)功能缺失評(píng)分為0分;Vehicle組在24h和72h神經(jīng)功能缺損評(píng)分均較嚴(yán)重，L-AS組在24h和72h與Vehicle組相比可降低神經(jīng)功能缺損，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，H-AS組在24h和72h與Vehicle組相比可明顯降低神經(jīng)功能缺損，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，H-AS對(duì)神經(jīng)功能缺損的這種改善作用可被ERK抑制劑PD98059阻斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;
　　 2.

19、與Vehicle組相比，L-AS組在24h和72h可降低腦含水量，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，H-AS組在24h和72h與Vehicle組相比可明顯降低腦含水量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，H-AS對(duì)腦水腫的降低作用可被ERK抑制劑PD98059阻斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　 3.與Vehicle組相比，L-AS組在24h和72h可減小腦梗死體積，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，H-AS組在

20、24h和72h與Vehicle組相比可明顯降低腦梗死體積，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，H-AS對(duì)腦梗死體積這種減小作用可被ERK抑制劑PD98059阻斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.免疫組化結(jié)果顯示，與Vehicle組相比，缺血后24h和72h，H-AS組在24h和72h均可明顯升高p-ERK、HO-1的陽性細(xì)胞數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);L-AS組在24h和72h可升高p-ERK、HO-1的陽

21、性細(xì)胞數(shù)，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），H-AS對(duì)p-ERK、HO-1陽性細(xì)胞數(shù)的升高作用可被ERK抑制劑PD98059阻斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 5.Westernblot結(jié)果顯示，與Vehicle組相比，H-AS在24h和72h可明顯升高p-ERK、HO-1的蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);L-AS組在24h和72h可升高p-ERK、HO-1的蛋白表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05

22、），H-AS對(duì)p-ERK、HO-1蛋白的升高作用可被ERK抑制劑PD98059阻斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6.與免疫組化和Westernblot結(jié)果一致，H-AS在24h和72h可升高ERK、HO-1的mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;L-AS組在24h和72h可升高ERK、HO-1的mRNA表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），H-AS對(duì)p-ERK、HO-1mRNA的升高作用可被ERK抑制

23、劑PD98059阻斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 7.與Vehicle組相比，H-AS可明顯增加SOD，減低MDA的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。L-AS組可增加SOD，減低MDA的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:局灶性腦缺血再灌注后，阿利吉侖對(duì)局灶性腦缺血再灌注小鼠具有腦保護(hù)作用，可改善神經(jīng)功能缺失，降低腦含水量，減小腦梗死體積，誘導(dǎo)ERK、HO-1的表達(dá)，增加SOD活性，

24、減少M(fèi)DA的含量，且上述保護(hù)作用可被ERK抑制劑PD98059阻斷，因此我們推測(cè)阿利吉侖的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過增加ERK、HO-1的表達(dá)，并增加SOD的活性，減少M(fèi)DA含量從而實(shí)現(xiàn)其抗氧化作用。
　　 第三部分:阿利吉侖對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠的抗凋亡作用及其相關(guān)機(jī)制研究
　　 目的:觀察腦缺血再灌注損傷后PI3K/Akt/Bcl-2/Bax的表達(dá)變化，研究阿利吉侖對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠的抗凋亡作用，探討阿利吉侖抗

25、凋亡作用的相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:選用成年雄性C57/BL小鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用改良線栓法制備大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。隨機(jī)將C57/BL小鼠分為5組:假手術(shù)組(Sham)，溶劑對(duì)照組(Verhicle)，阿利吉侖低劑量組(L-AS)，阿利吉侖高劑量組(H-AS)，阿利吉侖+LY-294002組(AS+LY-294002)。Sham組:假手術(shù)前連續(xù)5天以灌胃方式給予等量生理鹽水，每日一次;Vehicle組:術(shù)前連續(xù)5天以灌胃方式給

26、予等量生理鹽水，每日一次;小劑量阿利吉侖干預(yù)組(L-AS):術(shù)前連續(xù)5天以灌胃方式給予阿利吉侖10mg/Kg，每日一次;大劑量阿利吉侖干預(yù)組(H-AS):術(shù)前連續(xù)5天以灌胃方式給予阿利吉侖25mg/Kg，每日一次;阿利吉侖組+LY-294002組(Aliskiren+LY-294002):術(shù)前連續(xù)5天以灌胃方式給予阿利吉侖25mg/Kg，每日一次，術(shù)前15分鐘腦室注射30μgLY-294002。各組取材前進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，干濕重法測(cè)定腦

27、組織含水量，TTC染色評(píng)價(jià)腦梗死體積，將各組小鼠分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分后斷頭處死，采用免疫組化、Westernblot和RT-qPCR來觀察腦缺血后PI3K、Akt、Bcl-2及Bax的mRNA和蛋白水平動(dòng)態(tài)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.Sham組中未見小鼠神經(jīng)功能缺損，神經(jīng)功能缺失評(píng)分為0分;Vehicle組在24h和72h神經(jīng)功能缺損評(píng)分均較嚴(yán)重，L-AS組在24h和72h與Vehicle組相比可降低神經(jīng)

28、功能缺損，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，H-AS組在24h和72h與Vehicle組相比可明顯降低神經(jīng)功能缺損，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，H-AS對(duì)神經(jīng)功能缺損的這種改善作用可被PI3K抑制劑LY-294002阻斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　 2.與Vehicle組相比，L-AS組在24h和72h可降低腦含水量，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），H-AS組在24h和72h與Vehicle組相比可明

29、顯降低腦含水量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，H-AS對(duì)腦水腫的降低作用可被PI3K抑制劑LY-294002阻斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;
　　 3.與Vehicle組相比，L-AS組在24h和72h可減小腦梗死體積，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），H-AS組在24h和72h與Vehicle組相比可明顯降低腦梗死體積，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，H-AS對(duì)腦梗死體積這種減小作用可被PI3K抑制劑LY-2

30、94002阻斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.免疫組化結(jié)果顯示，與Vehicle組相比，缺血后24h和72h，H-AS組在24h和72h均可明顯升高p-PI3K、p-Akt、Bcl-2，降低Bax的陽性細(xì)胞數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);L-AS組在24h和72h可升高p-PI3K、p-Akt、Bcl-2，降低Bax的陽性細(xì)胞數(shù)，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），H-AS對(duì)p-PI3K、p-Akt、Bc

31、l-2、Bax陽性細(xì)胞數(shù)的作用可被P13K抑制劑LY-294002阻斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 5.Westernblot結(jié)果顯示，與Vehicle組相比，H-AS在24h和72h可明顯升高p-PI3K、p-Akt、Bcl-2，降低Bax的蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);L-AS組在24h和72h可升高p-PI3K、p-Akt、Bcl-2，降低Bax的蛋白表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），H

32、-AS對(duì)p-PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白的升高作用可被PI3K抑制劑LY-294002阻斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6.與免疫組化和Westernblot結(jié)果一致，H-AS在24h和72h可升高Bcl-2，降低Bax的mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;L-AS組在24h和72h可升高Bcl-2，降低Bax的mRNA表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，H-AS對(duì)Bcl-2、BaxmRN