丹酚酸B對局灶性腦缺血小鼠抑制自噬及凋亡機制的研究.pdf

1、目的:腦血管病是導致我國成人殘疾和死亡的第一原因，其中以缺血性腦血管病最為常見。腦缺血后繼發(fā)性腦損傷是病情加重及影響預后的重要原因，氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡及線粒體功能異常、鈣超載、興奮氨基酸毒性、自噬等因素均有參與。缺血性腦血管病機制復雜不明，目前缺乏有效治療手段，是亟待解決的醫(yī)學問題。
　　急性局灶腦缺血中，氧化應激可介導梗死區(qū)域繼發(fā)性神經元死亡。自噬在缺血再灌注情況下是一把雙刃劍，細胞可啟動適度的自噬來清除受損細胞器及異

2、常折疊蛋白質，對細胞起到重要的保護作用，但不完全或過度自噬現象可能導致細胞死亡。近來越來越多的實驗證據表明，氧化應激能誘導自噬的發(fā)生，并且，應用抗氧化劑能抑制自噬并減少細胞死亡。
　　丹酚酸B(Salvianolic acid B，SalB)是一種提取自丹參的水溶性單體成分，具有強大的抗氧化作用及其他多種生物學活性。SalB可以通過抑制凋亡的機制保護缺血心肌細胞，也有文獻報道SalB可通過抑制自噬來保護饑餓狀態(tài)的心肌細胞。

3、　　本實驗旨在研究SalB這一氧自由基清除劑對急性期局灶性腦缺血小鼠是否存在腦保護作用，且其作用機制是否為抑制凋亡及自噬水平。
　　方法:采用雄性CD1小鼠（體重25-30g），應用改良Longa法建立小鼠右側pMCAO模型。實驗分為三部分:
　　實驗一:探究SalB對急性期局灶性腦缺血小鼠的腦保護作用
　　小鼠隨機分為4組:Sham組（Sham+生理鹽水）、pMCAO組(pMCAO+生理鹽水)、丹酚酸B低劑量組（pM

4、CAO+SalB10mg/kg，Sal-L）、丹酚酸B高劑量組（pMCAO+SalB25mg/kg，Sal-H）。各組小鼠按照統(tǒng)一標準進行麻醉與造模，造模成功后，藥物干預組即刻腹腔注射SalB，Sham組和pMCAO組用則給予等量生理鹽水。術后24 h采用Longa法及Clark法對小鼠進行神經功能缺損評分。評分完畢后將動物斷頭處死，用干濕重法測定腦組織含水量，用TTC染色法測定腦梗死體積，用伊文斯蘭染色法測定血腦屏障通透性，用west

5、ern blot測定緊密連接蛋白Claudin-5的含量，用尼氏染色法測定梗死交界區(qū)神經細胞損傷情況，用電鏡觀察超微結構改變（梗死皮層超微結構如自噬體的形成、細胞凋亡情況和微血管損傷情況等）。
　　實驗二:局灶性腦缺血小鼠各因子分區(qū)表達
　　對Sham及pMCAO組小鼠于術后24h行免疫組織化學染色測定LC3、beclin1、p62、bcl2、bax、Caspase-3的陽性細胞分布情況及計數情況。行免疫熒光染色觀察becl

6、in1及Caspase-3是否存在共標。觀察western blot測定PGC-1α及Sirt1的分區(qū)表達。
　　實驗三:SalB腦保護作用機制的探究
　　首先，根據因子分區(qū)表達情況選定測定的分區(qū):LC3、beclin1、p62于梗死周邊區(qū)觀察;bcl2、bax、cleaved Caspase-3于梗死中心區(qū)觀察。應用western blot及RT-qPCR進行測定Sham組、pMCAO組、Sal-L組、Sal-H組相應分區(qū)

7、各因子的蛋白、mRNA含量的變化。
　　對不同分區(qū)凋亡相關信號通路重要因子MAPKs及能量代謝通路重要因子PGC-1α及Sirt1行western blot及RT-qPCR測定其蛋白、mRNA含量的變化。用DHE染色測定梗死側皮層ROS的生成量，分別應用MDA含量及SOD活力試劑盒測定梗死皮層脂質過氧化程度及機體清除氧自由基的能力。
　　總之，分別從凋亡、自噬、氧化應激三方面探討丹酚酸B腦保護作用機制。
　　結果:

8、r>　　1、丹酚酸B對急性期局灶性腦缺血小鼠具有保護作用
　　1.1丹酚酸B改善行為學評分
　　pMCAO術后24 h，分別采用Longa法及Clark法對各組小鼠進行行為學評分，對此采用Mann-Whitney U檢驗統(tǒng)計并分析結果。采用Longa評分法及Clark評分法時，與pMCAO組相比，Sal-L組和Sal-H組的神經功能評分明顯改善，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　1.2丹酚酸B降低腦梗死體積<

9、br>　　pMCAO術后24 h，Sal-L組和Sal-H組因藥物干預梗死體積明顯減小，且差異具統(tǒng)計學意義（Sal-L組和Sal-H組vs.pMCAO組:51.09％±12.65％和34.31％±7.93％ vs.65.94％±2.96％,P＜0.05）。
　　1.3丹酚酸B保護血腦屏障
　　1.3.1丹酚酸B減輕腦水腫: pMCAO術后24 h，Sal-L組和Sal-H組梗死側腦組織含水量較pMCAO組明顯減少(P＜0.0

10、5)。
　　1.3.2丹酚酸B降低血腦屏障通透性:局灶性腦缺血后24h，Sal-L組和Sal-H組右側大腦半球腦組織伊文斯蘭含量均明顯低于pMCAO組（P＜0.05）。
　　1.3.3丹酚酸B上調Claudin5表達:局灶性腦缺血后24h pMCAO組右側大腦半球Claudin5蛋白表達量降低，與Sham組比較有差異（P＜0.05）。pMCAO組左側半球與Sham組的Claudin5蛋白含量無統(tǒng)計學差異。應用SalB干預后，

11、Claudin5含量增加，緊密連接崩解減少，血腦屏障受到保護。
　　1.3.4丹酚酸B保護血腦屏障超微結構
　　取右側大腦半球皮層行電鏡檢測，結果顯示:除Sham組外均有不同程度內皮細胞受損，細胞核增大，緊密連接開放，基底膜模糊，可見紅細胞阻塞微血管，管周有液體滲出，周圍腦組織細胞水腫。pMCAO組最為嚴重，周圍組織高度水腫;Sal-H組較pMCAO組管周液體滲出減少，緊密連接較完好且基底膜更為完整。
　　1.4丹酚酸

12、B減少神經細胞損傷
　　1.4.1丹酚酸B增加尼氏染色中存活細胞數目，Sal-L組和Sal-H組較pMCAO組存活細胞數目增多(P＜0.05)。
　　1.4.2丹酚酸B改善組織超微結構，同時還可觀察到局灶性腦缺血后的自噬現象，pMCAO組小鼠梗死灶周圍皮層可見直徑平均500nm的雙層膜的自噬小體。
　　2、局灶性腦缺血后不同區(qū)域因子表達變化不同
　　2.1 pMCAO及Sham術后24小時，Caspase-3、b

13、ax、bcl2的免疫組織化學結果顯示Sham組bax及Caspase-3表達量很少，bcl2作為抗凋亡因子在正常組織中有一定程度的表達。梗死對側皮層組各因子陽性細胞數計數與Sham組無明顯差異;梗死中心皮層組Caspase-3及bax表達明顯上升，陽性細胞數目顯著增多（Core vs.Sham，P＜0.05），bcl2表達明顯下調，陽性細胞數目減少（Core vs.Sham，P＜0.05）;梗死周邊皮層組Caspase-3及bax表達有

14、所上調且有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)但幅度遠小于梗死中心皮層，bcl2表達上調且陽性細胞數增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　pMCAO組中，梗死中心皮層組各自噬相關指標幾乎未見陽性細胞，與Sham組有顯著差別，梗死對側皮層組自噬相關指標陽性細胞數目與Sham組相比無統(tǒng)計學差異。梗死周邊皮層自噬水平顯著提高，LC3、beclin1及p62表達均顯著上升(P＜0.05)。
　　2.2免疫熒光顯示beclin1+與C

15、aspase-3+細胞有明顯分界，未觀察到存在了beclin1+/Caspase-3+細胞包。
　　2.3腦缺血組織分區(qū):將腦皮層分為梗死對側皮層(Contralateral)，梗死周邊皮層(Pericore)及梗死中心皮層(Core)。Core組PGC-1α及Sirt1蛋白表達水平較sham組明顯下調，pericore組及contralateral組則較sham組上升。
　　3、丹酚酸B腦保護作用機制的探究
　　3.

16、1丹酚酸B的抗氧化作用:SalB通過清除ROS、降低梗死半球腦組織MDA含量并恢復SOD活性來抗氧化。
　　3.2丹酚酸B的抗凋亡作用:術后24小時，western blot結果顯示CleavedCaspase-3/GADPH及bax/bcl2比值較Sham組明顯升高。Sal-L組和Sal-H組較pMCAO組的Cleaved Caspase-3/GADPH及bax/bcl2比值明顯降低。RT-qPCR結果符合組織化學染色結果。用藥

17、后，Sal-L和Sal-H的Caspase-3及bax基因表達降低且有統(tǒng)計學差異。
　　3.3丹酚酸B抑制自噬的作用
　　自噬相關指標在蛋白表達層面包括LC3Ⅱ/GADPH、beclin1/GADPH及p62/GADPH;其相對應基因表達層面包括MAP1LC3b/ACTB、BECN1/ACTB及SQSTM1/ACTB。低劑量的SalB干預可明顯降低各個指標的表達量，高劑量效果較之稍遜色。與western blotting結果

18、一致，pMCAO組各指標mRNA的表達較Sham組明顯增加。與pMCAO組相比，Sal-L組各指標的表達量明顯減少，高劑量較之效果遜色，與Western blot結果一致。
　　3.4丹酚酸B下調梗死中心皮層p-p38及p-erk1/2表達
　　3.5丹酚酸B上調梗死周圍皮層Sirt1-PGC-1α通路的蛋白及基因表達
　　結論:
　　SalB對急性期局灶性腦缺血小鼠的具有腦保護作用，可以改善神經功能缺損評分（L

19、onga法及Clark法），降低梗死體積，保護血腦屏障，增加增加尼氏染色中存活細胞數目以及改善組織超微結構。
　　局灶性腦缺血中可觀察到細胞自噬現象，可見典型自噬體形成及自噬溶酶體的形成，也可觀察到典型的細胞凋亡。免疫組織化學檢測自噬相關因子及凋亡相關因子的表達及分布，發(fā)現兩者分布不同。自噬相關指標于梗死周邊皮層表達上調（如LC3及beclin1），凋亡相關指標主要于梗死中心皮層明顯變化（如cleaved Caspase-3及ba

20、x上調，bcl2下調），且Beclin1及Caspase-3進行雙標免疫熒光染色時未見共標。說明應分區(qū)討論于是取不同部位皮層進行蛋白及基因水平檢測。
　　SalB可于pericore區(qū)抑LC3Ⅱ及beclin1表達，但p62表達也減少并未堆積，說明自噬水平雖然降低，但自噬溶酶體仍能降解底物，說明SalB抑制了過度激活的自噬水平。Sirt1-PGC-1α也在此區(qū)域明顯激活，有利于能量代謝順利進行，減少損傷的線粒體，從而減低自噬的刺激