隱丹參酮對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血小鼠腦保護(hù)作用研究及機(jī)制探討.pdf

1、目的:缺血性腦血管病的發(fā)病率逐步增高，已成為世界范圍內(nèi)致殘和致死的主要疾病之一，嚴(yán)重危害人類健康。腦缺血后發(fā)生損傷性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，病理過程錯(cuò)綜復(fù)雜，主要涉及炎癥、氧化應(yīng)激、鈣超載、酸中毒以及凋亡。其中炎癥在腦缺血繼發(fā)性腦損傷病理過程中起重要作用，抑制炎性反應(yīng)成為探索缺血性腦血管病臨床藥物治療的重要切入點(diǎn)。
　　傳統(tǒng)醫(yī)藥因其可防治多種疾病而逐漸得到越來越多的關(guān)注。我們的既往研究評(píng)價(jià)了丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA，TanⅡA)在實(shí)

2、驗(yàn)性腦缺血模型中的腦保護(hù)作用，并發(fā)現(xiàn)此作用與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。該結(jié)果促使我們進(jìn)一步研究與丹參酮ⅡA結(jié)構(gòu)相近的隱丹參酮(Cryptotanshinone，CTs)對(duì)腦缺血的保護(hù)作用。隱丹參酮是從中藥丹參的根中分離提取出來的主要成分之一，亦具有顯著的抗炎作用。有研究報(bào)道隱丹參酮通過抑制MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。
　　與細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2

3、)相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路是經(jīng)典的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，近年研究顯示ERK1/2信號(hào)通路包含了負(fù)責(zé)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因子，并且可能是炎癥反應(yīng)中的重要信號(hào)通路。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)ERK1/2信號(hào)通路參與局灶性腦缺血病理過程，卒中后抑制該通路能夠有效抑制炎癥反應(yīng)，減小腦缺血區(qū)域，發(fā)揮腦保護(hù)作用。
　　ERK1/2是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，接受上游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)后活化為phospho-ERK1/2，穿過核膜轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化核內(nèi)的一

4、些轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)其基因表達(dá)。ETS樣蛋白1(ETS-like1，Elk-1)是ERK1/2下游的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子之一，其轉(zhuǎn)錄活性被激活后可進(jìn)一步活化c-fos，c-fos作為轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白激活劑蛋白-1(activator protein-1，AP-1)家族中的一員，可以調(diào)控多種炎性蛋白的合成，最終導(dǎo)致IL-1β和TNF-α等炎癥相關(guān)因子產(chǎn)生增多。
　　本實(shí)驗(yàn)在小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞(transient middle cerebr

5、al arteryocclusion，tMCAO)所致的腦缺血模型上研究隱丹參酮對(duì)于腦缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，并測(cè)定缺血腦組織phospho-ERK1/2、phospho-Elk1、IL-1β和claudin-5的表達(dá)變化，探討其腦保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　方法:采用成年健康雄性CD1小鼠，應(yīng)用改良Longa線栓法建立tMCAO小鼠模型。實(shí)驗(yàn)一:測(cè)定腦缺血后隱丹參酮的腦保護(hù)作用。隨機(jī)分為6組:tMCAO組、溶劑組(Vehicle，

6、tMCAO+1％Tween-80)、CTs小劑量組(CTs-L，tMCAO+CTs10 mg/kg)、CTs中劑量組(CTs-M，tMCAO+CTs20 mg/kg)、CTs大劑量組(CTs-H，tMCAO+CTs40 mg/kg)及假手術(shù)組(Sham)。給藥組動(dòng)物腦缺血1h再灌注后根據(jù)不同的組別立即腹腔注射相應(yīng)藥物，tMCAO組和Sham組立即給予等容積蒸餾水。再灌注后24 h采用Connolly等的4分法對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分;用2

7、％2，3，5-三苯基四唑氮紅(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法結(jié)合軟件圖像分析進(jìn)行腦梗死體積的測(cè)定;用干濕重法進(jìn)行腦組織含水量的計(jì)算。實(shí)驗(yàn)二:觀察隱丹參酮干預(yù)對(duì)于缺血腦組織ERK1/2信號(hào)通路及血腦屏障的影響，探討其腦保護(hù)作用的可能機(jī)制。隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(Sham)、溶劑組(Vehicle，tMCAO+1％Tween-80)及CTs大劑量組(CTs-H，tMCAO+CTs40 mg/kg)

8、。應(yīng)用免疫組化、Western Blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timereverse transcription-quantitative PCR，RT-qPCR)以及激光掃描共聚焦技術(shù)觀察phospho-ERK1/2、phospho-Elk1、IL-1β及claudin-5的表達(dá)情況，測(cè)定伊文斯蘭滲出了解血腦屏障破壞情況。
　　結(jié)果:
　　1.CT降低神經(jīng)功能評(píng)分。tMCAO、溶劑組、隱丹參酮給藥組小鼠均出現(xiàn)不同

9、程度的左側(cè)肢體偏癱。隱丹參酮大劑量組神經(jīng)功能評(píng)分較溶劑組明顯改善（P＜0.05）。小劑量組及中劑量組亦可降低神經(jīng)功能評(píng)分，但與溶劑組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.CTs減小腦梗死體積(percentage hemisphere lesion volume，％HLV)。假手術(shù)組無梗死灶。與溶劑組(％HLV:44.48％±2.07％)相比，CTs小劑量組、中劑量組和大劑量組梗死體積均明顯減小(CTs-L％HLV:39

10、.42％±0.76％; CTs-M％HLV:37.65％±1.12％; CTs-H％HLV:32.53％±0.33％,P＜0.05)，CTs大劑量組較小劑量組和中劑量組更為顯著（P＜0.05）。
　　3.CTs減少腦組織含水量。三個(gè)隱丹參酮給藥組與溶劑組相比腦組織含水量均有所下降(CTs-H vs.Vehicle:80.98％±0.98％ vs.83.48％±0.49％,P＜0.05; CTs-M vs.Vehicle:81.64

11、％±0.64％ vs.83.48％±0.49％，P＜0.05; CTs-L vs.Vehicle:82.36％±1.62％ vs.83.48％±0.49％，P＜0.05),但三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　4.CTs下調(diào)phospho-ERK1/2，phospho-Elk1及IL-1β的表達(dá)。腦缺血1h再灌注24 h后，缺血腦組織phospho-ERK1/2，phospho-Elk1陽性細(xì)胞數(shù)、蛋白水平以及IL-1β(

12、mRNA)表達(dá)水平均上升，給予大劑量隱丹參酮(40mg/kg)后，phospho-ERK1/2、phospho-Elk1及IL-1β(mRNA)表達(dá)量明顯減少。
　　5.CTs改善血腦屏障的通透性。血腦屏障破壞后伊文斯蘭滲出，大劑量CTs(40 mg/kg)可明顯減少伊文斯蘭滲出。腦缺血后claudin-5表達(dá)減少，Western Blot以及RT-qPCR顯示大劑量CTs(40 mg/kg)可以在基因和蛋白水平上使缺血腦組織cl

13、audin-5的表達(dá)上調(diào)。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:腦梗死早期給予隱丹參酮干預(yù)后，神經(jīng)功能評(píng)分改善，腦梗死體積減小，腦組織含水量降低，phospho-ERK1/2，phospho-Elk1及IL-1β表達(dá)水平下調(diào)，claudin-5表達(dá)水平上調(diào)，伊文斯蘭滲出減少。本研究提示隱丹參酮干預(yù)可以對(duì)腦缺血后腦組織產(chǎn)生劑量依賴性神經(jīng)保護(hù)作用。其機(jī)制可能與下調(diào)phospho-ERK1/2，phospho-Elk1及IL-