MicroRNA130a通過(guò)調(diào)節(jié)干擾素信號(hào)通路及丙酮酸代謝調(diào)控HCV及HBV復(fù)制的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)感染是導(dǎo)致嚴(yán)重肝臟疾病的主要原因之一。目前，全球約有HBV慢性感染者2.57億人，HCV慢性感染者7100萬(wàn)人，對(duì)公共健康造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。目前，乙肝的治療藥物主要有干擾素和核苷類(lèi)似物兩種，干擾素治療應(yīng)答率低，而核苷類(lèi)藥物治療易復(fù)發(fā)。丙肝治療的傳統(tǒng)方法為長(zhǎng)效干擾素聯(lián)合利巴韋林，但毒副作用大，且對(duì)HCV基因Ⅰ型病毒應(yīng)答率低。近年，靶向HCV蛋白酶和聚合酶的直接抗病毒藥物(Direc

2、t-acting Antivirals，DAAs)的飛速發(fā)展極大的提高了抗病毒應(yīng)答率，但是一些不足之處也逐漸顯現(xiàn)，如在HBV/HCV共感染的患者中，DAAs藥物易造成HBV的復(fù)發(fā)，加之DAAs藥物價(jià)格昂貴，因此，尋找新的抗病毒策略，尤其是能同時(shí)抵抗HCV和HBV兩種病毒的廣譜抗病毒策略，仍然是非常有必要的。
　　保持自身的代謝和激發(fā)免疫應(yīng)答是宿主細(xì)胞在受到外界刺激，如病毒感染時(shí)，維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的兩個(gè)方面。microRNAs在調(diào)節(jié)宿主代

3、謝和免疫應(yīng)答中均起著極為重要的作用。有研究顯示，在HCV及HBV感染的病人肝組織及體外細(xì)胞培養(yǎng)模型中，miR-130a的表達(dá)發(fā)生明顯的改變;同時(shí)有研究顯示，miR-130a表達(dá)的改變對(duì)HCV及HBV的復(fù)制具有調(diào)節(jié)作用。在研究中發(fā)現(xiàn)miR-130a能調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素及其下游干擾素刺激基因的表達(dá)，同時(shí)miR-130a靶作用于丙酮酸激酶PKLR，調(diào)節(jié)PKLR的表達(dá)及其催化的丙酮酸生成反應(yīng)。但是針對(duì)miR-130a調(diào)節(jié)HCV和HBV的復(fù)制及宿主免

4、疫是否與丙酮酸代謝存在關(guān)聯(lián)，目前尚不清楚。
　　研究目的:
　　1、探索miR-130a對(duì)HCV和HBV復(fù)制的影響;
　　2、鑒定miR-130a作用的靶基因;
　　3、闡述miR-130a調(diào)控HCV和HBV復(fù)制的分子機(jī)制。
　　研究?jī)?nèi)容:
　　第一部分miR-130a通過(guò)調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素信號(hào)通路調(diào)控HCV復(fù)制的研究;
　　第二部分miR-130a與維生素D協(xié)同抗HCV作用研究;
　　第三部

5、分miR-130a通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因PKLR的表達(dá)調(diào)控HCV和HBV復(fù)制的研究;
　　第四部分PKLR及丙酮酸調(diào)控HCV和HBV復(fù)制的研究。
　　研究方法:
　　1、將miR-130a模擬物(mimic)轉(zhuǎn)染HCV復(fù)制子細(xì)胞（Con1b細(xì)胞）及JFH1感染的Huh7.5.1細(xì)胞（JFH1細(xì)胞），使miR-130a高表達(dá)，檢測(cè)miR-130a高表達(dá)對(duì)內(nèi)源性IFNα/β生成、干擾素刺激基因(ISGs)表達(dá)及HCV RNA復(fù)制的

6、影響;在干擾素受體缺陷的細(xì)胞U5A中及其母細(xì)胞2fTGH中轉(zhuǎn)染miR-130a模擬物，檢測(cè)兩種細(xì)胞中，ISGs的表達(dá)，明確miR-130a對(duì)ISGs表達(dá)的影響是否依賴(lài)于干擾素與其受體的結(jié)合。
　　2.在Con1b及JFH1感染的Huh7.5.1細(xì)胞中，加入骨化三醇（Calcitriol，VD的活性形式）處理、轉(zhuǎn)染miR-130a模擬物或轉(zhuǎn)染miR-130a模擬物的同時(shí)加入骨化三醇處理，檢測(cè)骨化三醇、miR-130a對(duì)HCV復(fù)制、I

7、FNα/β表達(dá)的影響，并檢測(cè)二者是否具有協(xié)同作用。
　　3、采用四種預(yù)測(cè)軟件(TargetScan、miRanda、RNAhybrid及PITA)對(duì)miR-130a可能發(fā)揮作用的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對(duì)可能作用的三個(gè)靶基因(IL18BP、PKLR及LDLR)進(jìn)行驗(yàn)證。在HCV復(fù)制子細(xì)胞OR6、JFH1感染的Huh7.5.1、JFH1感染的人原代肝細(xì)胞(PHHs)中或者HBV細(xì)胞系HepAD38、HBV感染的pN

8、TCP-PHHs、HBV感染的pNTCP-Huh7.5.1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-130a模擬物(mimic)或者miR-130a表達(dá)抑制物(inhibitor)或者CRISPR/Cas/9gRNA，考察miR-130a過(guò)表達(dá)、抑制或基因沉默對(duì)HCV RNA復(fù)制、HBV DNA復(fù)制及對(duì)PKLR表達(dá)的影響。
　　4、靶基因功能研究，通過(guò)構(gòu)建PKLR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行過(guò)表達(dá)或者通過(guò)小分子干擾RNA(siRNA)或CRISPR/

9、Cas9技術(shù)使其沉默，檢測(cè)PKLR過(guò)表達(dá)及沉默對(duì)HCV及HBV復(fù)制的影響。同時(shí)考察PKLR催化反應(yīng)產(chǎn)物丙酮酸對(duì)HCV、HBV復(fù)制的影響，以及補(bǔ)充丙酮酸是否對(duì)miR-130a高表達(dá)及PKLR沉默引起的病毒復(fù)制的抑制具有營(yíng)救效果。
　　研究結(jié)果:
　　1、JFH1感染的Huh7.5.1及HCV復(fù)制子細(xì)胞Con1b中，miR-130a過(guò)表達(dá)后，HCVRNA復(fù)制顯著降低，Ⅰ型干擾素(IFNα/β)及一些ISGs基因(Mx1，CH25

10、H)的表達(dá)顯著增加，但miR-130a的表達(dá)不受IFNα刺激的影響。此外，在干擾素受體IFNAR2c缺失的U5A細(xì)胞中，miR-130a高表達(dá)對(duì)ISGs基因無(wú)上調(diào)作用，提示miR-130a對(duì)ISGs的調(diào)節(jié)是通過(guò)干擾素信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　2、骨化三醇不影響miR-130a的表達(dá);miR-130a過(guò)表達(dá)及骨化三醇均顯著抑制HCVRNA復(fù)制，兩者具有一定的疊加作用。miR-130a過(guò)表達(dá)及骨化三醇均顯著促進(jìn)IFNα/β的表達(dá)，但在mi

11、R-130a過(guò)表達(dá)的同時(shí)加入骨化三醇，IFNα/β的表達(dá)低于單獨(dú)處理組。miR-130a過(guò)表達(dá)及骨化三醇均顯著抑制HCV入胞受體LDLR的表達(dá)及HCV的入胞吸附過(guò)程，且同時(shí)處理具有一定的疊加作用。這些結(jié)果提示，miR-130a過(guò)表達(dá)與骨化三醇的抗病毒疊加效應(yīng)與Ⅰ型干擾素信號(hào)通路無(wú)關(guān)，很可能是通過(guò)調(diào)節(jié)病毒的吸附入胞實(shí)現(xiàn)的。
　　3、通過(guò)四種不同的軟件對(duì)miR-130a可能作用的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得2152個(gè)潛在的靶基因，其中有534

12、個(gè)基因同時(shí)由2種以上的軟件獲得;通過(guò)文獻(xiàn)檢索的方法，從中篩選了116個(gè)與病毒感染及肝臟疾病相關(guān)的基因進(jìn)行研究，通過(guò)熒光定量PCR的方法，發(fā)現(xiàn)，在miR-130a高表達(dá)的細(xì)胞中，PKLR（編碼丙酮酸激酶，廣泛存在于肝臟及紅細(xì)胞中），IL18BP（編碼白介素18結(jié)合蛋白），LDLR（編碼低密度脂蛋白受體）三個(gè)基因的表達(dá)顯著降低。對(duì)這三個(gè)基因，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果證實(shí)PKLR為miR-130a的靶基因，而IL18BP和LDLR不

13、是。miR-130a高表達(dá)顯著抑制PKLR的表達(dá)和HCV、HBV的復(fù)制;miR-130a表達(dá)抑制或基因沉默顯著促進(jìn)PKLR的表達(dá)及HCV和HBV的復(fù)制。
　　4、PKLR過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)HCV及HBV的復(fù)制;PKLR基因沉默顯著抑制HCV及HBV的復(fù)制。無(wú)丙酮酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞，當(dāng)向培養(yǎng)基中加入丙酮酸溶液后，HCV及HBV的復(fù)制顯著增加，且在miR-130a過(guò)表達(dá)及PKLR沉默的實(shí)驗(yàn)組中加入丙酮酸，丙酮酸對(duì)miR-130a高表達(dá)及

14、PKLR沉默導(dǎo)致的HCV、HBV復(fù)制的抑制具有營(yíng)救作用。但是PKLR及丙酮酸處理均不影響miR-130a的表達(dá)，提示PKLR及丙酮酸位于miR-130a調(diào)節(jié)通路的下游。
　　研究結(jié)論:
　　1、miR-130a過(guò)表達(dá)顯著抑制HCV及HBV的復(fù)制;而miR-130a表達(dá)抑制或基因沉默顯著促進(jìn)HCV及HBV的復(fù)制。miR-130a高表達(dá)與骨化三醇對(duì)HCV復(fù)制的抑制具有疊加效應(yīng)。
　　2、miR-130a過(guò)表達(dá)上調(diào)IFNα/