組蛋白去乙?；?特異性促進(jìn)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷.pdf

1、目的:
　　糖尿病腎病是糖尿病微血管病變之一，也是導(dǎo)致終末期腎病最重要的原因。血流動(dòng)力學(xué)改變、異常的糖脂代謝、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等機(jī)制均在糖尿病腎病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。近年的研究表明蛋白乙?；碛^修飾參與到上述各種發(fā)病機(jī)制并發(fā)揮越來越重要的作用，并有可能成為治療腎臟疾病的藥物靶點(diǎn)。組蛋白去乙?；?HDAC)與組蛋白乙?；?HAT)在體內(nèi)共同作用，完成對(duì)蛋白組乙?；降恼{(diào)控。目前人體內(nèi)共有18種HDAC亞型，根據(jù)基因的同

2、源性共分為4大類，Ⅰ類HDAC包括HDAC1、2、3、8;Ⅱ類HDAC又分為Ⅱa和Ⅱb兩大類，Ⅱa類包括HDAC4、5、7、9，Ⅱb類HDAC包括HDAC6、10;Ⅲ類HDAC包括SIRT1-7;Ⅳ類HDAC只有HDAC11。其中ⅠⅡⅣ類HDAC的酶活性是Zn2+依賴型而Ⅲ類HDAC酶活性屬于NAD+依賴型。Ⅰ類HDAC主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，而Ⅱ類HDAC則在不同機(jī)制的調(diào)控下存在核質(zhì)穿梭過程。不同亞型HDAC的功能具有很大差異，因此明確各

3、亞型HDAC在腎臟疾病中的作用機(jī)制具有非常重要的意義。
　　作為抗腫瘤藥物成功上市的HDAC抑制劑極大的推動(dòng)了乙?；揎椀难芯糠秶６囗?xiàng)研究表明，HDAC抑制劑可以通過抗炎和抗纖維化等機(jī)制發(fā)揮對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用，其中涉及到對(duì)EGF-EGFR信號(hào)通路及eNOS信號(hào)通路的調(diào)控。目前的研究均使用HDAC非特異性抑制劑，HDAC各亞型在腎臟疾病的發(fā)病過程發(fā)揮的功能尚不清楚，雖有研究發(fā)現(xiàn)HDAC2在STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠及db/db

4、小鼠中活性增強(qiáng)，并且HDAC2在TGF-β1刺激下活性增高，促進(jìn)了腎小管EMT過程的發(fā)生，但是目前各亞型HDAC在腎小球細(xì)胞中的表達(dá)以及功能仍未見報(bào)道，因此HDAC在腎小球細(xì)胞中的作用機(jī)制是研究重點(diǎn)。小分子HDAC抑制劑主要作用于Zn2+依賴型HDAC，因此闡明Zn2+依賴型HDAC在糖尿病腎病中的作用機(jī)制對(duì)HDAC抑制劑應(yīng)用于腎臟疾病治療有著重大意義。
　　足細(xì)胞損傷發(fā)生在糖尿病腎病的起始階段，足細(xì)胞從基底膜脫落導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量的減

5、少，進(jìn)而引起蛋白尿的產(chǎn)生。多種信號(hào)通路參與糖尿病引起的足細(xì)胞損傷過程，目前越來越多的研究表明自噬活性的改變是導(dǎo)致腎臟疾病以及足細(xì)胞損傷的重要原因之一，但糖尿病腎病條件下自噬的調(diào)控機(jī)制尚未明確。最近的一項(xiàng)研究顯示，STAT1在糖尿病腎病的發(fā)病過程中發(fā)揮著自噬抑制作用。STAT1具有乙?；揎椢稽c(diǎn)，但在糖尿病腎病條件下HDAC是否對(duì)STAT1進(jìn)行乙?；叫揎椷M(jìn)而影響STAT1的功能迄今未見報(bào)道，因此研究STAT1乙酰化水平的修飾對(duì)于闡明糖

6、尿病腎病發(fā)病過程中自噬水平的調(diào)控具有重要意義。
　　方法:
　　1.動(dòng)物學(xué)研究:
　　1.1 STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟皮質(zhì)組織中HDAC各亞型的表達(dá)檢測(cè):選取30SD大鼠，雄性，體重200-250g，隨機(jī)分成兩組，即正常對(duì)照組和STZ誘導(dǎo)糖尿病腎病組。通過測(cè)定大鼠空腹血糖及24h尿量、尿蛋白水平確定糖尿病腎病模型構(gòu)建成功。分別采用Real-time RT-PCR、蛋白免疫印跡法(Western Blot，WB)和免疫

7、組織化學(xué)法(Immunohistochemistry，IHC)，檢測(cè)HDAC各個(gè)亞型在糖尿病腎病大鼠腎臟皮質(zhì)組織中表達(dá)的變化。
　　1.2Ⅱ型糖尿病腎病db/db小鼠腎皮質(zhì)組織中HDAC2、HDAC4及HDAC5表達(dá)檢測(cè):WB方法檢測(cè)db/+組小鼠與db/db組小鼠腎皮質(zhì)組織中HDAC2、HDAC4及HDAC5表達(dá)的變化。
　　2.糖尿病腎病腎活檢樣本研究:
　　從山東大學(xué)病理學(xué)教研室獲得正常人、糖尿病腎病病人、糖尿病

8、非腎病病人、局灶性節(jié)段性腎小球硬化病人活檢樣本。IHC檢測(cè)糖尿病腎病病人腎活檢樣本中HDAC2、HDAC4及HDAC5蛋白水平;Real-time RT-PCR檢測(cè)腎活檢標(biāo)本中HDAC2、HDAC4及HDAC5mRNA水平，統(tǒng)計(jì)HDAC2、HDAC4及HDAC5 mRNA水平與估算腎小球?yàn)V過率(eGFR)的相關(guān)性;檢測(cè)HDAC4 mRNA水平在FSGS標(biāo)本中的表達(dá);檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1、ATG5、ATG7 mRNA水平

9、。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)研究:
　　3.1HDAC2、HDAC4及HDAC5在腎臟固有細(xì)胞中的表達(dá):體外培養(yǎng)腎臟固有細(xì)胞，包括系膜細(xì)胞、足細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞以及腎小管上皮細(xì)胞;體外模擬糖尿病腎病病理狀態(tài)，WB檢測(cè)腎臟固有細(xì)胞中HDAC2、HDAC4及HDAC5在高糖(HG)、糖基化終末產(chǎn)物(AGE)、和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)刺激下的表達(dá)。
　　3.2 HDAC4表達(dá)的干預(yù)以及對(duì)足細(xì)胞功能的影響:轉(zhuǎn)染shRNA

10、-HDAC4質(zhì)?；虺聊慵?xì)胞中的HDAC4并轉(zhuǎn)染足細(xì)胞pCMV6-HDAC4質(zhì)粒過表達(dá)HDAC4蛋白;ELISA檢測(cè)HG刺激以及HDAC4基因沉默對(duì)足細(xì)胞致炎因子和生長(zhǎng)因子水平的影響;采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HG以及HDAC4基因沉默對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響。
　　3.3HDAC4對(duì)足細(xì)胞自噬水平的調(diào)控:WB檢測(cè)HG，HDAC基因沉默及HDAC4基因過表達(dá)對(duì)足細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;使用電鏡觀察HDAC4基因沉默對(duì)足細(xì)胞自噬的影響;使用

11、腺病毒為載體的GFP-RFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，檢測(cè)HDAC4基因沉默對(duì)足細(xì)胞自噬流的影響。
　　3.4HDAC4基因沉默介導(dǎo)的自噬激活對(duì)足細(xì)胞功能的影響:WB檢測(cè)HDAC4基因沉默以及Rapamycin干預(yù)對(duì)足細(xì)胞nephrin、podocin表達(dá)的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)HDAC4基因沉默以及Rapamycin干預(yù)對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響;通過免疫熒光對(duì)足細(xì)胞微絲蛋白F-actin染色并應(yīng)用激光共聚焦觀察，檢測(cè)HDAC4基因沉默以及

12、Rapamycin干預(yù)對(duì)足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響。
　　結(jié)果:
　　1動(dòng)物模型中Zn2+依賴型HDAC各亞型的表達(dá):
　　1.1 STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟組織中HDAC表達(dá)的變化
　　Real-time RT-PCR及WB檢測(cè)Zn2+依賴型HDAC各亞型的表達(dá)，結(jié)果顯示，糖尿病腎病模型組HDAC2、HDAC4及HDAC5的mRNA與蛋白水平顯著上調(diào)，而HDAC1、3、6、7、8、9、10及11的mRNA與蛋白表達(dá)水

13、平并沒有顯著性差別，相一致，模型組腎臟組織石蠟切片中HDAC2、HDAC4及HDAC5的表達(dá)顯著性上調(diào)。
　　1.2Ⅱ型糖尿病腎病db/db小鼠腎皮質(zhì)組織中HDAC2、HDAC4及HDAC5表達(dá)的變化
　　WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與db/+組小鼠相比，db/db組小鼠中腎皮質(zhì)組織中HDAC2、HDAC4及HDAC5的蛋白水平顯著上調(diào)。
　　2.糖尿病腎病及FSGS患者腎活檢標(biāo)本中HDAC2、HDAC4及HDAC5表達(dá)的變化

14、>　　IHC結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病患者腎活檢標(biāo)本中HDAC2、HDAC4及HDAC5的蛋白表達(dá)顯著升高;糖尿病腎病腎活檢標(biāo)本中HDAC4和HDAC5的mRNA水平顯著升高，HDAC2的mRNA水平有升高趨勢(shì)但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HDAC2、HDAC4及HDAC5的mRNA水平與eGFR值成負(fù)相關(guān);FSGS腎活檢標(biāo)本中HDAC4 mRNA水平顯著升高。
　　3.體外研究HDAC4在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷過程中的功能及作用機(jī)制:

15、
　　3.1 損傷因子誘導(dǎo)足細(xì)胞中HDAC4表達(dá)的變化
　　足細(xì)胞中HDAC4在HG、AGE和TGF-β1的刺激下表達(dá)顯著上調(diào)并呈濃度依賴性。應(yīng)用synpatopodin抗體標(biāo)記足細(xì)胞，檢測(cè)糖尿病腎病模型組足細(xì)胞中HDAC4的表達(dá)，與體外的結(jié)果一致，HDAC4在模型組足細(xì)胞中表達(dá)特異性上調(diào)。
　　3.2 HDAC4基因沉默能夠減少高糖引起的足細(xì)胞炎癥反應(yīng)及足細(xì)胞的凋亡
　　Real-time RT-PCR檢測(cè)致炎

16、因子和生長(zhǎng)因子的水平，結(jié)果顯示，基因沉默HDAC4可以緩解高糖引起的炎癥反應(yīng)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HDAC4的基因沉默可以減少高糖引起的足細(xì)胞凋亡，同時(shí)過表達(dá)HDAC4的質(zhì)粒能夠促進(jìn)足細(xì)胞的凋亡。
　　3.3 HDAC4促進(jìn)HG引起的足細(xì)胞自噬功能障礙
　　WB檢測(cè)LC3B及Beclin1的表達(dá)，結(jié)果顯示，HG能夠降低LC3BⅡ/LC3BⅠ值及LC3B和Beclin1的表達(dá)，HDAC4基因沉默能夠顯著增強(qiáng)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，

17、HDAC4過表達(dá)能夠進(jìn)一步降低自噬相關(guān)蛋白的表達(dá);電鏡觀察顯示HDAC4基因沉默能夠增加足細(xì)胞中自噬小體的個(gè)數(shù);轉(zhuǎn)染足細(xì)胞腺病毒載體GFP-RFP-LC3質(zhì)粒，標(biāo)記足細(xì)胞內(nèi)自噬小體以及自噬流的變化，通過激光共聚焦觀察顯示HDAC4基因沉默不僅能夠增加自噬小體的數(shù)量，還能夠增加自噬溶酶體的形成。
　　結(jié)論:
　　1.首次明確了參與糖尿病腎病病理生理過程的Zn2+依賴型HDAC的亞型，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HDAC4在促進(jìn)足細(xì)胞炎性反應(yīng)與

18、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為深入研究乙酰化修飾在糖尿病腎病中的作用機(jī)制，篩選特定HDAC作為糖尿病腎病早期診斷的標(biāo)志物，尋找新的治療靶標(biāo)，指導(dǎo)設(shè)計(jì)和開發(fā)針對(duì)HDAC亞型的抑制劑并更好地應(yīng)用于糖尿病腎病的防治提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　2.HDAC4通過降低與機(jī)體的炎癥過程及自噬調(diào)控密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT1)的乙?；?，引起STAT1的磷酸化并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)而活化，從而激活相應(yīng)炎性基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，促