海洋放線菌基因組文庫的構(gòu)建和功能基因的克隆及序列分析.pdf

1、LibraryConstructwithGenomicDNAFragmentsandCloningfunctionGeneoffromMarineactinomyceteandSequenceanalysis么碭esisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementFortheMSDegreeinBiochemistryandMolecularBiologyByMaYanlingPostgra

2、duateProgramCollegeofLifeSciencesCentralChinaNormalUniversitySupervisor：QiChaoLiAiyingAcademicTitle：ProfessorAssociateProfessorSignature盈j幽ApprovedMay2011⑨碩士學(xué)位論文MASTER’STHESIS以稀有海洋放線菌Salinisporaarenicola和Streptomycessp為實

3、驗材料，隨機機械剪切提取的總DNA，5’磷酸末端補平回收40kb左右的DNA片段，與pWEB珊載體連接，經(jīng)包裝蛋白包裝成噬菌體后侵染宿主細(xì)胞EcoliEPI啪，構(gòu)建該菌株的基因組文庫，并對該文庫進行質(zhì)量鑒定。稀有海洋放線菌Salinisporaarenicola的基因組文庫的效價達65x104CFI7／mI，，得到3000個陽性克隆子，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于按覆蓋率為999％計算至少所需的1380個陽性克隆子數(shù)，且平均插入片段長度為36kb，重組率接

4、近100％。成功構(gòu)建的稀有海洋放線菌Streptomycessp的基因組文庫，效價達90x104CFU／mL，得到4000個陽性克隆子，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于按覆蓋率為99％計算至少所需的837個陽性克隆子數(shù)，且平均插入片段長度為36kb，重組率同樣接近100％。陽性克隆子保存于96孔板中，80℃保存。所構(gòu)建文庫的各項指標(biāo)均達到要求，為了進一步評估Salinisporaarenicola和Streptomycessp所能合成的所有潛在天然產(chǎn)物，還需要

5、進一步檢測該文庫中包含有生物合成基因簇的大腸桿菌的表達情況。實驗后期成功克隆了稀有海洋放線菌Salinisporaarenicola的非核糖體肽合成酶(NI沖S)和鹵化酶生物合成基因簇核心區(qū)基因片段。根據(jù)己發(fā)表的放線菌NRPS和鹵化酶生物合成基因簇核心區(qū)的核苷酸序列保守區(qū)設(shè)計兩對簡并性引物，采用PCR的方法擴增NRPS和鹵化酶生物合成基因簇核心區(qū)基因片段，并使用分子生物學(xué)軟件進行了序列分析。所獲得的兩段基因片段大小分別為660bp和55

6、5bp，分別編碼220個和185個氨基酸。這兩段序列與海洋放線菌SalinisporaarenicolaCNS205的NRPS和鹵化酶生物合成基因簇核心區(qū)基因核苷酸序列的同源性分別為99％和98％。最終成功地獲得了稀有海洋放線菌Salinisporaarenicola的NRPS和鹵化酶生物合成基因簇核心區(qū)基因片段，該基因片段的獲取將為分離全長基因簇以及研究該基因簇在生物合成中的功能奠定基礎(chǔ)?；P(guān)鍵詞：海洋放線菌；基因組文庫；腺苷?；Y(jié)構(gòu)