海洋放線菌基因組文庫(kù)的構(gòu)建和功能基因的克隆及序列分析.pdf

1、LibraryConstructwithGenomicDNAFragmentsandCloningfunctionGeneoffromMarineactinomyceteandSequenceanalysis么碭esisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementFortheMSDegreeinBiochemistryandMolecularBiologyByMaYanlingPostgra

2、duateProgramCollegeofLifeSciencesCentralChinaNormalUniversitySupervisor：QiChaoLiAiyingAcademicTitle：ProfessorAssociateProfessorSignature盈j幽ApprovedMay2011⑨碩士學(xué)位論文MASTER’STHESIS以稀有海洋放線菌Salinisporaarenicola和Streptomycessp為實(shí)

3、驗(yàn)材料，隨機(jī)機(jī)械剪切提取的總DNA，5’磷酸末端補(bǔ)平回收40kb左右的DNA片段，與pWEB珊載體連接，經(jīng)包裝蛋白包裝成噬菌體后侵染宿主細(xì)胞EcoliEPI啪，構(gòu)建該菌株的基因組文庫(kù)，并對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量鑒定。稀有海洋放線菌Salinisporaarenicola的基因組文庫(kù)的效價(jià)達(dá)65x104CFI7／mI，，得到3000個(gè)陽(yáng)性克隆子，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于按覆蓋率為999％計(jì)算至少所需的1380個(gè)陽(yáng)性克隆子數(shù)，且平均插入片段長(zhǎng)度為36kb，重組率接

4、近100％。成功構(gòu)建的稀有海洋放線菌Streptomycessp的基因組文庫(kù)，效價(jià)達(dá)90x104CFU／mL，得到4000個(gè)陽(yáng)性克隆子，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于按覆蓋率為99％計(jì)算至少所需的837個(gè)陽(yáng)性克隆子數(shù)，且平均插入片段長(zhǎng)度為36kb，重組率同樣接近100％。陽(yáng)性克隆子保存于96孔板中，80℃保存。所構(gòu)建文庫(kù)的各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到要求，為了進(jìn)一步評(píng)估Salinisporaarenicola和Streptomycessp所能合成的所有潛在天然產(chǎn)物，還需要

5、進(jìn)一步檢測(cè)該文庫(kù)中包含有生物合成基因簇的大腸桿菌的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)后期成功克隆了稀有海洋放線菌Salinisporaarenicola的非核糖體肽合成酶(NI沖S)和鹵化酶生物合成基因簇核心區(qū)基因片段。根據(jù)己發(fā)表的放線菌NRPS和鹵化酶生物合成基因簇核心區(qū)的核苷酸序列保守區(qū)設(shè)計(jì)兩對(duì)簡(jiǎn)并性引物，采用PCR的方法擴(kuò)增NRPS和鹵化酶生物合成基因簇核心區(qū)基因片段，并使用分子生物學(xué)軟件進(jìn)行了序列分析。所獲得的兩段基因片段大小分別為660bp和55

6、5bp，分別編碼220個(gè)和185個(gè)氨基酸。這兩段序列與海洋放線菌SalinisporaarenicolaCNS205的NRPS和鹵化酶生物合成基因簇核心區(qū)基因核苷酸序列的同源性分別為99％和98％。最終成功地獲得了稀有海洋放線菌Salinisporaarenicola的NRPS和鹵化酶生物合成基因簇核心區(qū)基因片段，該基因片段的獲取將為分離全長(zhǎng)基因簇以及研究該基因簇在生物合成中的功能奠定基礎(chǔ)?；P(guān)鍵詞：海洋放線菌；基因組文庫(kù)；腺苷酰化結(jié)構(gòu)