雞白痢沙門氏菌基因組文庫的構(gòu)建及其必需基因的篩選.pdf

1、雞白痢沙門氏菌是腸桿菌科沙門氏菌屬的成員，對禽類具有高度的適應(yīng)性和專嗜性，是目前危害世界養(yǎng)雞業(yè)的病原之一。近年來，雞白痢沙門氏菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，急需開發(fā)安全、高效、種屬特異的抗菌藥物。
　　 必需基因是維持一個(gè)細(xì)胞的生命活動(dòng)所必不可少的基因，去除一個(gè)必需基因或者使其不表達(dá)或產(chǎn)物失活均會(huì)使一個(gè)生物體無法繼續(xù)存活，所以微生物必需基因的翻譯產(chǎn)物就有可能成為抗細(xì)菌藥物的靶點(diǎn)。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用用隨機(jī)PCR的方法獲得雞白痢沙門氏

2、菌基因組的隨機(jī)片段，將隨機(jī)片段與pIDM1質(zhì)粒連接，該質(zhì)粒含有一個(gè)溫度敏感復(fù)制起始蛋白R(shí)epAts，導(dǎo)致其在30℃能復(fù)制，而在37℃不能復(fù)制。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1，共獲得約5×105個(gè)克隆。肉眼目測藍(lán)白斑比例約為1:9，隨機(jī)挑取菌落，應(yīng)用PCR方法進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果文庫目的片段的插入率為90％(9/10)。將合并所有克隆抽提的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入雞白痢沙門氏菌，得到約5×105個(gè)克隆，隨機(jī)挑取白色菌落，接種于含四環(huán)素的培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)30h，

3、作適當(dāng)稀釋后涂布于四環(huán)素平板，37℃培養(yǎng)48h，重復(fù)驗(yàn)證平板上有無細(xì)菌生長，以判定插入片段的必需性。
　　 如果37℃平板上有細(xì)菌生長，則該菌株所含質(zhì)粒的克隆片段為非必需基因片段，選取篩選的非必需基因gidA，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其不同長度的片段，與pIDM-T連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG1，抽提質(zhì)粒轉(zhuǎn)入本菌株，轉(zhuǎn)換溫度培養(yǎng)測定不同片段的IPC值；反之，37℃平板上無細(xì)菌生長，則該菌株所含質(zhì)粒的插入片段為必需基因部分或空載體。實(shí)驗(yàn)從12384