海參cDNA文庫的構(gòu)建和序列分析以及組織蛋白酶L基因的克隆.pdf

1、應(yīng)用Gubler-HoffmancDNALibraryConstruction技術(shù),構(gòu)建仿刺參cDNA文庫。測試結(jié)果表明,庫容量為2.0×106pfu/ml,利用PCR方法檢測cDNA文庫插入DNA片段的大小,其長度范圍在0.5-4.1kb,插入片段平均長度為1.3kb,表明該文庫達(dá)到建庫要求,可用來篩選低豐度mRNA的基因克隆。隨機挑選100個1kb以上的cDNA克隆進(jìn)行測序分析,發(fā)現(xiàn)有26條EST序列和網(wǎng)上公布其它物種的序列相似性較

2、高,這些基因與刺參能量代謝和蛋白水解相關(guān)。其中發(fā)現(xiàn)的幾個重要基因,如編碼遍在蛋白以及纈酪肽蛋白和組織酶L相關(guān)蛋白等,可能與仿刺參自溶過程的蛋白酶水解和細(xì)胞凋亡事件相關(guān)。另有74條EST序列相似性較低,推測可能是功能未知的新基因。組織蛋白酶L是一種嗜酸性溶酶體蛋白水解酶,廣泛存在于人體各種正常組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中,它不僅參與生物體內(nèi)各種蛋白水解,還參與許多重要的生命活動,如抗原呈遞、腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移、骨質(zhì)吸收、細(xì)胞凋亡等。研究表明,組織蛋白

3、酶L和組織蛋白酶L相關(guān)蛋白是同一蛋白的不同亞基,組織蛋白酶L相關(guān)蛋白和組織蛋白酶L以對接形式存在,組織蛋白酶L相關(guān)蛋白對組織蛋白酶L的靶向作用和表達(dá)及其活性起著重要的作用。通過對刺參cDNA文庫的部分篩選和序列分析,我們發(fā)現(xiàn)了一條組織蛋白酶L相關(guān)蛋白基因(GenBank:EU306878)。全長cDNA為1335bp,5’非編碼區(qū)(UTR)91bp,3’UTR489b,開放閱讀框長度756bp,編碼251個氨基酸。為此我們提取刺參總RN