腸出血型大腸埃希菌O157-H7候選疫苗的構(gòu)建及動(dòng)物效果評(píng)價(jià).pdf

1、目的:
　　腸出血型大腸埃希菌（Enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157∶H7為人畜共患病，臨床上可引起出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥。目前對(duì)EHECO157∶H7感染尚缺乏有效的防治措施，安全有效的疫苗是預(yù)防其感染的首選。本研究選擇EspA和Tir兩個(gè)關(guān)鍵性定植功能蛋白候選抗原，同時(shí)構(gòu)建具EspA-Tir-M融合蛋白為抗原的亞單位候選疫苗和以嗜酸乳桿菌為抗原投遞系統(tǒng)的活載體候選疫苗

2、菌株，并評(píng)價(jià)其保護(hù)效果。
　　方法:
　　首先通過(guò)重疊延伸PCR方法擴(kuò)增目的片段EspA-Tir-M，將EspA-Tir-M與原核質(zhì)粒pET28a(+)連接，構(gòu)建大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)和純化濃縮蛋白EspA-Tir-M。將制備EspA-Tir-M蛋白分別通過(guò)滴鼻和皮下注射兩種方式免疫小鼠，測(cè)定小鼠血清IgG、糞便SIgA，血清中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10的表達(dá)水平，并進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，觀察小鼠的死亡

3、率、排菌量及組織病理切片，對(duì)比兩種免疫方式的保護(hù)效果;其次，再將EspA-Tir-M融合基因與pMG36e質(zhì)粒連接后電轉(zhuǎn)化至嗜酸乳桿菌感受態(tài)，構(gòu)建表達(dá)EspA-Tir-M的重組嗜酸乳桿菌，并進(jìn)行多重PCR和測(cè)序鑒定重組嗜酸乳桿菌，進(jìn)行SDS-PAGE及Western Blot分析重組嗜酸乳桿菌表達(dá)的蛋白情況;并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)該重組嗜酸乳桿菌的保護(hù)效果，體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、排斥實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞骨架染色，觀察重組嗜酸乳桿菌抑制EHEC O157

4、∶H7黏附LoVo細(xì)胞及預(yù)防A/E損傷形成的效果，體內(nèi)考察重組嗜酸乳桿菌灌胃免疫小鼠后，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體和細(xì)胞因子的表達(dá)水平，以及EHEC O157∶H7攻毒后對(duì)小鼠的保護(hù)效果。
　　結(jié)果:
　　本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建EspA-Tir-M原核表達(dá)系統(tǒng)，且誘導(dǎo)表達(dá)的EspA-Tir-M主要以可溶性形式存在，純化后蛋白純度可達(dá)90％，將蛋白采取皮下和滴鼻兩種免疫方式，結(jié)果表明滴鼻免疫比皮下免疫可更好的誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性I

5、gG和SIgA，滴鼻免疫可提高IL-4、IL-10和IFN-γ的表達(dá)水平，而皮下免疫只能提高IL-10和IFN-γ的表達(dá)水平，此外，滴鼻免疫的保護(hù)率高達(dá)88.9％，病理切片也顯示滴鼻免疫可有效預(yù)防EHEC O157∶H7對(duì)腸道的損傷，而皮下免疫的保護(hù)效果則較差。同時(shí)首次成功構(gòu)建了表達(dá)EHEC O157∶H7EspA-Tir-M蛋白的重組嗜酸乳桿菌，且主要以外分泌表達(dá)可溶性蛋白;重組嗜酸乳桿菌體外實(shí)驗(yàn)可競(jìng)爭(zhēng)性排斥達(dá)60％EHEC O157

6、∶H7黏附LoVo細(xì)胞，而預(yù)防性排斥高達(dá)94％，并且可阻止EHEC O157∶H7對(duì)LoVo細(xì)胞造成A/E損傷;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明重組嗜酸乳桿菌可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的IgG和SIgA，提高小鼠血清中IFN-γ、IL-4和IL-10的表達(dá)水平，對(duì)小鼠的保護(hù)率達(dá)77.8％，并有效縮短糞便排菌量和排菌時(shí)間，病理切片顯示有效減輕EHEC O157∶H7引起的A/E損傷。
　　結(jié)論:
　　本研究首次構(gòu)建了預(yù)防EHEC O157∶H7的新型