腸出血性大腸桿菌O157-H7適配體的篩選及初步應用研究.pdf

1、腸出血性大腸桿菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7，E.coli O157:H7）是與公共衛(wèi)生有關(guān)的重要的食源性致病菌，對公眾的健康造成了巨大的威脅，實現(xiàn)對其準確快速的檢測至關(guān)重要。利用指數(shù)級富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)，從人工合成的隨機寡核苷酸文庫中篩選得到的一段單鏈DNA或RNA片

2、段稱為適配體（aptamer）。適配體能夠形成特定的結(jié)構(gòu)，與靶物質(zhì)高特異性、高親和力地結(jié)合，因此可以作為高靈敏度以及高特異性的識別元件應用于多個領(lǐng)域的檢測系統(tǒng)。
　　本研究采用消減（subtractive）Cell-SELEX技術(shù)，篩選獲得了特異性識別E.coli O157:H7單鏈DNA(ssDNA)適配體，并且進一步結(jié)合納米磁顆粒建立了水樣和食品中E.coli O157:H7的新型檢測方法。體外合成中間隨機序列為45個堿基，全

3、長88個堿基的單鏈DNA文庫；以E.coli O157:H7為靶細菌，利用消減CELL-SELEX技術(shù)經(jīng)過7輪重復篩選，挑選出與靶細胞結(jié)合效率最高的第六輪篩選結(jié)合子進行克隆測序。應用軟件Chromas和DNAMAN對測序結(jié)果進行家族同源性分析和模擬二級結(jié)構(gòu)的分析，篩選出具有代表性的序列人工合成并標記異硫氰酸熒光素（FITC），使用熒光化學分析儀、流式細胞儀以及激光共聚焦顯微鏡對適配體進行親和性與特異性測定。篩選得到1條與E.coli O

4、157:H7特異性結(jié)合的適配體A46，其解離常數(shù)Kd值為82.45±18.46nM（nmol/L）。其次，將適配體A46進行生物素化修飾，然后與鏈霉親和素包被的納米磁顆粒結(jié)合，以此作為捕獲探針，以熒光FITC標記的適配體A46作為熒光探針，構(gòu)建了大腸桿菌O157:H7的實際檢測應用方法。在最優(yōu)的實驗條件下，E.coli O157:H7檢測的線性范圍是90～5×104cfu/ml，最低檢出濃度是88cfu/ml，實際水樣中加標檢測率最高為