耐火陶瓷纖維致人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B凋亡的研究.pdf

1、研究背景： 石棉因具有保溫、絕緣、耐高溫等性能而廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。由于石棉已是國際公認(rèn)的職業(yè)病危害因素，可誘發(fā)石棉肺和惡性腫瘤(如支氣管肺癌、間皮瘤等)石棉相關(guān)疾病，發(fā)達(dá)國家已經(jīng)嚴(yán)格限制石棉的使用，而大力提倡使用石棉替代品。耐火陶瓷纖維(Refractory Ceramic Fibers，RCF)與石棉具有相似的理化特性，是目前應(yīng)用較為廣泛的石棉替代品，但其對(duì)人體的危害性及其危害機(jī)理是衛(wèi)生學(xué)研究的重要課題。一些體外實(shí)驗(yàn)可以提供

2、耐火陶瓷纖維等石棉替代品對(duì)人體的生物危害效應(yīng)及其分子作用機(jī)理等有價(jià)值的信息，其中用耐火陶瓷纖維刺激肺間皮細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞的體外試驗(yàn)研究已有較多的文獻(xiàn)報(bào)道，但人造礦物纖維對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞，特別是支氣管上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道較少。本項(xiàng)研究通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)、形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法和手段，研究耐火陶瓷纖維致體外人支氣管上皮細(xì)胞(Human Bronchial Epithelial Cells，BEAS-2B)細(xì)胞凋亡和DNA損傷的作用

3、，為探尋耐火陶瓷纖維誘發(fā)人體支氣管肺癌的病變機(jī)理提供依據(jù)，為臨床診治提供參考。 研究目的： 研究不同理化組成和不同濃度的耐火陶瓷纖維及其浸出液對(duì)體外培養(yǎng)的BEAS-2B的形態(tài)變化、凋亡、DNA損傷的作用，以及相關(guān)凋亡基因caspases-3、PARP的表達(dá)水平，測試耐火陶瓷纖維及其浸出液誘導(dǎo)BEAS-2B產(chǎn)生ROS的效應(yīng)，以及CAT、DMSO和甘露的抗氧化作用，初步明確RCF對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性和氧化機(jī)理。

4、 研究方法： 細(xì)胞培養(yǎng)：BEAS-2B細(xì)胞以RPMI1640培養(yǎng)液加10％胎牛血清、青霉素100U/ml、慶大霉素10mg/L、兩性霉素-B2mg/L、谷氨酰胺2mM和非必需氨基酸，在37℃、5慶大霉素10mg/L、兩性霉素-B2mg/L、谷氨酰胺2mM和非必需氨基酸，在37℃、5％CO2、100％濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周傳代1次，傳代后第3天更換新鮮培養(yǎng)液。 細(xì)胞毒性試驗(yàn)：倒置顯微鏡下觀察BEAS-2B細(xì)胞對(duì)臺(tái)盼藍(lán)(

5、TrypanBlue)的吞噬，以鑒定細(xì)胞的成活率；檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的量，以評(píng)價(jià)耐火陶瓷纖維對(duì)細(xì)胞的毒性：噻唑藍(lán)(MTT)法測定耐火陶瓷纖維對(duì)細(xì)胞活力的影響。 細(xì)胞形態(tài)觀察：HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化，掃描電鏡觀察細(xì)胞吞噬纖維行為。 單細(xì)胞凝膠電泳：檢測耐火陶瓷纖維及其浸出液對(duì)細(xì)胞DNA的損傷程度及細(xì)胞自身DNA修復(fù)能力。 DNALADDER試驗(yàn)：用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA技術(shù)檢測耐火陶瓷纖維及其浸出液致BEA

6、S-2B細(xì)胞凋亡作用。 YO-PRO-1和PI聯(lián)合染色定量檢測細(xì)胞凋亡：用YO-PRO-1和PI聯(lián)合染色定量檢測耐火陶瓷纖維及其浸出液致細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例。 RT-PCR檢測mRNA水平：用耐火陶瓷纖維懸液及浸出液刺激BEAS-2B細(xì)胞后，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR法檢測細(xì)胞中caspases-3、caspases9和PARP1的表達(dá)水平。 細(xì)胞內(nèi)ROS的測定：以耐火陶瓷纖維刺激BEAS-2B細(xì)

7、胞，用熒光探針2'，7'-二氯熒光素二脂(DCFH-DA)和雙氫羅丹明123(DHR123)測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平，并用CAT、DMSO和甘露醇觀察它們對(duì)ROS產(chǎn)生的抑制作用。 結(jié)果： BEAS-2B細(xì)胞成活率及青石棉毒性：細(xì)胞吞噬臺(tái)盼藍(lán)(TrypanBlue)實(shí)驗(yàn)顯示，20μg/cm2濃度的耐火陶瓷纖維作刺激細(xì)胞24h后，95％的細(xì)胞拒染；400μg/ml耐火陶瓷纖維浸出液刺激細(xì)胞24h后，大于93％的細(xì)胞拒染；MTT實(shí)

8、驗(yàn)表明，100μg/cm2以上濃度的耐火陶瓷纖維刺激BEAS-2B細(xì)胞24h后，細(xì)胞活力明顯下降。 細(xì)胞形態(tài)：HE染色可見凋亡細(xì)胞，纖維粘附在細(xì)胞上；電鏡下可見20μg/cm2耐火陶瓷纖維刺激24h后，細(xì)胞微絨毛消失，表面光滑，細(xì)胞有吞噬纖維行為。 BEAS-2B細(xì)胞的DNA損傷及DNA修復(fù)：經(jīng)三種20μg/cm2耐火陶瓷纖維懸液及400μg/ml浸出液刺激后，細(xì)胞產(chǎn)生DNA拖尾現(xiàn)象，與陰性對(duì)照組比較均有顯著性差異(P＜

9、0.05，n=3)，有時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。移去刺激物后，細(xì)胞的DNA損傷得到不同程度的修復(fù)?？寡趸瘎┛梢詼p少DNA損傷。 細(xì)胞凋亡：20μg/cm2耐火陶瓷纖維懸液及400μg/ml浸出液刺激48h后，細(xì)胞產(chǎn)72h后小于22％。 Caspases-3、PARP1和caspases9的mRNA水平：20μg/cm2耐火陶瓷纖維懸液及400μg/ml浸出液刺激24h及48h后細(xì)胞中caspases-3、caspases9的mRN

10、A水平高于空白組，PARP1的mRNA水平低于對(duì)照組。 細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生量：熒光探針DHR123與DCFH-DA檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，用CAT、DMSO和甘露醇預(yù)處理BEAS-2B細(xì)胞后，耐火陶瓷纖維及懸液刺激細(xì)胞產(chǎn)生的ROS量減少。所以，耐火陶瓷纖維誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS以H2O2和-OH為主。 結(jié)論： 1.耐火陶瓷纖維及浸出液致BEAS-2B細(xì)胞DNA損傷，且有時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。 2.去除耐火陶瓷纖維及浸出

11、液刺激后，DNA損傷得以修復(fù)，抗氧化劑可減少DNA損傷。 3.耐火陶瓷纖維及浸出液致BEAS-2B細(xì)胞凋亡，凋亡相關(guān)基因caspase-3、caspase-9的mRNA水平隨刺激時(shí)間增加而增加，PARP1的mRNA水平隨刺激時(shí)間而輕度下降，抗氧化劑可以抑制caspase-3，caspase-9的表達(dá)，增加PARP1的表達(dá)。 4.耐火陶瓷纖維懸液及浸出液誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞產(chǎn)生ROS，產(chǎn)生的ROS以羥自由基(-OH)和過