新發(fā)及罕見侵襲性真菌病原體的基因組研究及分子診斷.pdf

1、侵襲性真菌感染((invasive fungal infection，IFI)是指侵犯皮膚角質(zhì)層以下，粘膜、內(nèi)臟器官及深部組織，在一定條件下可播散至全身的感染，包括真菌血癥和深部組織感染。近30年來，由于艾滋病、腫瘤、糖尿病等免疫功能低下患者的增加，創(chuàng)傷性醫(yī)療操作、器官移植的增多，長期使用抗生素等因素，侵襲性真菌感染的發(fā)病率和死亡率顯著上升，同時新突發(fā)的真菌侵襲病例也不斷涌現(xiàn)。相比侵襲性真菌的來勢兇猛，人們對它的研究還比較薄弱，真菌的基

2、因組測序、分子診斷、藥物開發(fā)都相對少于對病毒及細(xì)菌的研究。本課題通過對新發(fā)及疑難罕見真菌病原體進(jìn)行全基因組測序分析和分子診斷方法的研究，從而達(dá)到全基因組數(shù)據(jù)的構(gòu)建、近緣種屬進(jìn)化的探究、致病相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)、可能致病機(jī)制的推測、分子診斷標(biāo)志物的預(yù)測等目的，為進(jìn)一步進(jìn)行預(yù)防、診斷、治療等研究奠定基礎(chǔ)。
　　本文建立了結(jié)合二、三代測序數(shù)據(jù)進(jìn)行新發(fā)及罕見侵襲性病原真菌基因組de novo拼接及深度解析致病因子的方案。對于新發(fā)的侵襲性致病真菌

3、膠囊青霉（Penicillium capsulatum）和伊蒙菌新種（Emmonsia sp.5z489）在無參考基因組的情況下，首次測得他們的全基因組序列，進(jìn)行從頭拼接，得到了完整度很高的基因組圖譜，并對它們及近緣菌進(jìn)行了毒力因子的解析和進(jìn)化研究。2011年以來，以Illumina MiSeq和HiSeq為代表的第二代測序技術(shù)迅速發(fā)展，極大提高了測序通量，縮短了測序時間，降低了測序成本，基因組學(xué)研究迎來了革命性突破。但是二代測序讀長比

4、較短，這就增添了后期的序列拼接、注釋、比對等生物信息學(xué)分析的難度，尤其對于有較多重復(fù)序列的真核生物基因組的從頭拼接。以Pacbio RSII為代表的第三代測序技術(shù)具有長讀長的優(yōu)勢，在基因組測序中能夠成功跨越重復(fù)區(qū)，降低了測序后基因組拼接、分析的工作量。但是，第三代測序的錯誤率相比一代和二代都要顯著增加，單堿基錯誤率可達(dá)到10~15％。可見這些測序技術(shù)各有不同的優(yōu)勢與缺憾，所以對于不同的基因組研究目的，需要選擇合適的測序方案。本研究建立了

5、二、三代測序數(shù)據(jù)融合的方案解決了新發(fā)及罕見致病性真菌基因組的從頭拼接難題，并深入分析其遺傳信息，取得了較好的效果。
　　膠囊青霉屬于散囊菌目青霉屬，它曾用于工業(yè)造紙，以往未見到有致病性報道。青霉屬真菌在人們的日常生活中起著非常重要的作用，極少對人致病。本研究所涉及的膠囊青霉更是鮮見的由青霉引起深部侵襲性感染的案例。2013年我國真菌學(xué)家首次在一位II型糖尿病人肺部發(fā)現(xiàn)膠囊青霉感染的菌團(tuán)并進(jìn)行分離培養(yǎng)。本研究通過將二代Illumin

6、a MiSeq測序平臺與三代Pacbio RSII測序平臺相結(jié)合的技術(shù)方案，繪制它的全基因組圖譜，分析其系統(tǒng)進(jìn)化，闡明了其中容易產(chǎn)生爭議的分類進(jìn)化關(guān)系，為分子進(jìn)化研究提供了新的視角。并將其毒力相關(guān)因子分成7類：
　　1）與熱耐受相關(guān)的毒力因子。
　　2）與細(xì)胞壁合成及結(jié)構(gòu)相關(guān)的毒力因子。
　　3）與抵抗人體免疫系統(tǒng)相關(guān)的毒力因子。
　　4）與毒素分泌相關(guān)的毒力因子。
　　5）與侵襲宿主過程中攝取營養(yǎng)物質(zhì)相關(guān)

7、的毒力因子。
　　6）與信號傳導(dǎo)、適應(yīng)人體環(huán)境相關(guān)的毒力因子。
　　7）與過敏原相關(guān)的毒力因子，進(jìn)行了細(xì)致的分析，對如何研究一種新發(fā)侵襲性真菌的致病性提供了參考方案。
　　伊蒙菌是一種雙相真菌，在環(huán)境中以菌絲相存在，在哺乳動物組織中則會形成酵母樣細(xì)胞。伊蒙菌的宿主一般是嚙齒類動物，侵襲人類從而引發(fā)深部感染的伊蒙菌是比較罕見的。但是近年來新英格蘭醫(yī)學(xué)連續(xù)報道了南非 HIV感染人群被伊蒙菌深部侵襲的病案，引發(fā)了人們的高度關(guān)

8、注。我國首例伊蒙菌侵襲肺部的病案是由協(xié)和醫(yī)院于2005發(fā)現(xiàn)的?；颊咴粦岩墒欠谓Y(jié)核，但相應(yīng)治療無效，經(jīng)病原菌培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)及ITS序列鑒定為是罕見的伊蒙菌深部感染，這個新種被命名為東方伊蒙菌，菌株號為Emmonsia sp.5z489。本研究首次將我國自主發(fā)現(xiàn)的這株侵襲性伊蒙菌新種進(jìn)行全基因組測序。仍采用二代Illumina MiSeq平臺與三代Pacbio RSII平臺相融合的方案，結(jié)合了兩者短序列深度測序和長序列測序跨越重復(fù)區(qū)的優(yōu)

9、勢，可以達(dá)到高完整度和可信度的拼接結(jié)果，并基于病原體與宿主之間相互作用的毒力因子數(shù)據(jù)庫（Pathogen-Host Interaction database，PHI)進(jìn)行這一新種的毒力因子分析。進(jìn)而將我國新發(fā)現(xiàn)的侵襲性伊蒙新種Emmonsia sp.5z489與國際上報道的3種侵襲性伊蒙菌進(jìn)行比較，重點分析毒力因子的異同和進(jìn)化關(guān)系。發(fā)現(xiàn)這株東方伊蒙菌Emmonsia sp.5z489與南非Emmonsia sp.CAC-2015的進(jìn)化關(guān)

10、系最近，它們都是侵襲人類的致病菌。而另外兩株感染動物的伊蒙菌進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，且毒力因子的數(shù)量也少于人類致病菌。并且利用基因組數(shù)據(jù)所做的進(jìn)化研究發(fā)現(xiàn)分離自挪威一只倉鼠身上的致病伊蒙菌Emmonsia parva是與芽生菌（Blastomyces）分在一個屬，這也是近年來對伊蒙菌分類爭議的一個焦點，我們的研究為國際真菌學(xué)家要求重新對Ajellomycetaceae菌科伊蒙菌屬進(jìn)行分類提供了一定的依據(jù)，同時也為進(jìn)一步研究侵襲動物和人的病原菌演變

11、進(jìn)程、致病機(jī)制提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
　　隱球菌腦膜炎是一種非常嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，預(yù)后不良，死亡率高。致病菌主要是新生隱球菌，通常感染的是免疫缺陷人群。但從1999年以來，在加拿大不列顛哥倫比亞省、溫哥華島和美國北部等地區(qū)發(fā)現(xiàn)人類隱球菌感染的暴發(fā)流行，其病原菌不是新生隱球菌，而是格特隱球菌，這種格特隱球菌可引起免疫正常人群罹患肺炎和腦膜炎，從而越來越受到全球范圍的重視。而我國有關(guān)格特隱球菌致病機(jī)理的研究數(shù)據(jù)相對較少，更鮮有基因組的

12、報道，國內(nèi)首例格特隱球菌是1980年由長征醫(yī)院真菌學(xué)家廖萬清教授報道的。本研究所獲得格特隱球菌也是由廖萬清院士團(tuán)隊從隱球菌腦膜炎患者的腦脊液中分離培養(yǎng)得到的病原菌，本研究將其進(jìn)行深度測序，全基因組拼接，并基于病原體與宿主之間相互作用的毒力因子數(shù)據(jù)庫進(jìn)行毒力因子分析。
　　由于侵襲性真菌病具有發(fā)病隱匿、臨床表現(xiàn)易被基礎(chǔ)病掩蓋、病死率與致殘率高等特點，早期、準(zhǔn)確的診斷對于及時救治意義重大。致病菌的分離培養(yǎng)、表型鑒定是臨床上確診IFI的

13、主要依據(jù)。但真菌培養(yǎng)耗時長，某些病原菌生長條件苛刻，培養(yǎng)過程中容易被其他環(huán)境菌污染，并且對于己使用抗感染藥物的患者培養(yǎng)結(jié)果假陰性率很高。而分子診斷具有高效、及時、準(zhǔn)確的特點，為侵襲性真菌的早期診斷提供了有力的依據(jù)。但是以往的分子診斷主要是依靠單個或多個序列的PCR實驗來鑒定，這樣的技術(shù)已經(jīng)不能滿足判定新發(fā)及罕見真菌感染的需求。本研究首次利用新一代測序技術(shù)對不可培養(yǎng)的疑難真菌侵襲病例進(jìn)行直接“從樣本到序列”的宏基因組測序方案進(jìn)行全部序列信

14、息的掃描，并進(jìn)一步用單細(xì)胞測序技術(shù)分離可疑病原體進(jìn)行測序、拼接、比對。最終得到了比較可靠的診斷結(jié)果，對臨床治療進(jìn)行了有效的指導(dǎo)，并對如何鑒定不可培養(yǎng)的疑難真菌病原體提供了一個新的研究方法。
　　綜上所述，測序技術(shù)突飛猛進(jìn)的發(fā)展為醫(yī)學(xué)帶來了更廣闊的發(fā)展前景。侵襲性真菌的來勢兇猛提示我們要以更先進(jìn)更精準(zhǔn)的方法去認(rèn)識、預(yù)防、診治深部真菌感染。本課題利用二、三代測序技術(shù)，通過對新發(fā)及罕見侵襲性真菌病原體的基因組研究及分子診斷，為加深對真菌