人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇對阿爾茨海默鼠的干預(yù)及SIRT1分子信號的調(diào)控.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,病理典型病變?yōu)槟X內(nèi)淀粉樣沉積、纖維樣纏繞、神經(jīng)元凋亡與缺失。AD是最常見的癡呆類型，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性學(xué)習(xí)記憶能力下降、失語、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變，并可危及生命，嚴(yán)重影響病人及家人生活質(zhì)量。中國目前約有600萬AD病人，此數(shù)據(jù)還在不斷遞增，預(yù)計到2050年將達(dá)到2000萬。然而，目前AD病因和發(fā)病機(jī)制尚不

2、明確，也無有效的治療方案。
　　干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的潛能，是再生醫(yī)學(xué)中的研究焦點(diǎn)。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（ human umbilical cord derived Mesenchymal stem cells， hUC-MSCs）來源于臍帶，具有取材方便、免疫原性低、適用于自體和異體移植等優(yōu)點(diǎn)，而且，與胚胎干細(xì)胞相比，hUC-MSCs不存在倫理爭議、無畸胎瘤的風(fēng)險，因此，具有較好的臨床應(yīng)用前景。此外，MSCs體外擴(kuò)增能力較

3、強(qiáng)、具有神經(jīng)樣細(xì)胞分化的潛能，并能夠分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，為AD的神經(jīng)再生與修復(fù)提供希望。但是，研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的干細(xì)胞隨傳代、擴(kuò)增發(fā)生一系列形態(tài)和功能的改變，移植到體內(nèi)的干細(xì)胞受微環(huán)境的影響存活、定位和功能發(fā)揮也受到限制，因此，如何調(diào)控干細(xì)胞體內(nèi)外的生物學(xué)特性和功能對干細(xì)胞的研究和應(yīng)用具有重要的意義。
　　白藜蘆醇是天然的植物抗毒素，存在于葡萄、花生、虎杖、藜蘆、決明等植物中的非黃酮類多酚化合物。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過調(diào)控SI

4、RT1( silent mating type information regulation2 homolog1)的活性與表達(dá)水平進(jìn)而對細(xì)胞、組織和機(jī)體的抗氧化、能量代謝、衰老和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等多方面生物學(xué)特性發(fā)揮重要的調(diào)控作用。SIRT1即Sirtuin1(silent mating type information regulation2 homolog)1是NAD+依賴的去乙酰化Sirtuins家族成員之一，在一定條件誘導(dǎo)下，可在細(xì)胞

5、核與細(xì)胞質(zhì)之間穿梭，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、氧化應(yīng)激等。動物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇及SIRT1信號對神經(jīng)修復(fù)和再生具有促進(jìn)作用。但是SIRT1表達(dá)隨細(xì)胞和機(jī)體衰老而下降，有研究者提出，SIRT1可作為AD早期診斷的標(biāo)記物和治療的分子靶點(diǎn)，然而，白藜蘆醇是否能夠通過 SIRT1分子信號在體內(nèi)外調(diào)控MSCs的命運(yùn)，白藜蘆醇聯(lián)合hUC-MSCs是否能更好地促進(jìn)其神經(jīng)再生、改善學(xué)習(xí)記憶、干預(yù)AD鼠的病理進(jìn)程有待研究探討。
　　目的
　　

6、明確不同劑量白藜蘆醇對 hUC-MSCs體外增殖、神經(jīng)分化、衰老、細(xì)胞周期和凋亡作用的量效關(guān)系，以及 SIRT1信號相關(guān)分子的改變。分析白藜蘆醇聯(lián)合hUC-MSCs移植對轉(zhuǎn)基因AD鼠腦內(nèi)hUC-MSCs存活和遷移的影響，確定白藜蘆醇聯(lián)合hUC-MSCs移植對AD鼠的行為學(xué)、病理學(xué)以及SIRT1信號分子的調(diào)控，為優(yōu)化AD療效提供新思路。
　　方法
　　1、體外實(shí)驗(yàn)研究白藜蘆醇對hUC-MSCs自我更新和神經(jīng)樣分化及SIRT1信

7、號分子表達(dá)的影響
　　無菌條件下收集新生兒臍帶，體外分離、培養(yǎng)、鑒定和凍存hUC-MSCs。采用不同濃度的白藜蘆醇（0.1、1、2.5、5、10μmol/L）刺激第四代hUC-MSCs6天后，CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性；EdU染色法檢測細(xì)胞增殖；PI染色、Annexin V-FITC/PI染色及流式細(xì)胞儀術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡；β-半乳糖苷酶染色檢測細(xì)胞衰老；qRT-PCR和 Western Blotting檢測細(xì)胞SIRT1及下

8、游分子PCNA、p53、p21和p16的表達(dá)；多步法誘導(dǎo)hUC-MSCs神經(jīng)分化后，細(xì)胞免疫熒光法檢測神經(jīng)標(biāo)記物Nestin、βIII-tubulin、NSE的表達(dá)；qRT-PCR檢測神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子Ngn1、Ngn2、Mash1的表達(dá)。
　　2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索白藜蘆醇聯(lián)合hUC-MSCs移植對AD鼠的干預(yù)效果以及腦內(nèi)SIRT1信號分子表達(dá)的影響
　　APP695V717I轉(zhuǎn)基因AD小鼠飼養(yǎng)、繁殖、鑒定并分組。共分為6組，每組15

9、只：對照組（WT），APP695V717I轉(zhuǎn)基因小鼠組（AD）、hUC-MSCs移植組（MSCs）、白藜蘆醇預(yù)處理hUC-MSCs移植組（RES-MSCs）、白藜蘆醇灌胃聯(lián)合hUC-MSCs移植組（MSCs+RES）、白藜蘆醇灌胃組（RES）。治療8周后， Morris水迷宮檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；免疫組化檢測小鼠腦內(nèi) hUC-MSCs的存活、APP的表達(dá)、神經(jīng)再生標(biāo)記物Nestin、βIII-tubulin的表達(dá)、小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1和

10、星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)；TUNEL檢測小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡；比色法測小鼠血清超氧化物歧化酶（ Superoxide dismutase, SOD）活性以及脂質(zhì)過氧化物（Malondialdehyde, MDA）含量；Western Blotting檢測磷酸化Tau蛋白的表達(dá)；qRT-PCR檢測海馬內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF、NGF和NT-3）以及炎癥因子（TNF-α、IL-1β和 IL-10）的表達(dá)變化；qRT-PCR和Western B

11、lotting檢測海馬組織中SIRT1、PCNA、p53、acetylized-p53（ac-p53）、p21和p16的表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　1、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：白藜蘆醇對hUC-MSCs的細(xì)胞活性、增殖、衰老、凋亡、細(xì)胞周期、神經(jīng)分化以及 SIRT1信號分子的調(diào)節(jié)具濃度依賴性調(diào)節(jié)作用。
　　1.1 CCK8結(jié)果顯示：與對照組相比，0.1、1、2.5μmol/L白藜蘆醇處理6天活性細(xì)胞數(shù)目顯著增加（P<0.05）

12、，而5和10μmol/L白藜蘆醇處理6天活性細(xì)胞顯著減少（P<0.05）。
　　1.2 EdU結(jié)果顯示：與對照組相比，0.1、1、2.5μmol/L白藜蘆醇處理6天促進(jìn)hUC-MSCs細(xì)胞增殖（P<0.05），而5和10μmol/L白藜蘆醇處理6天則抑制細(xì)胞增殖（P<0.05）。
　　1.3 PI染色結(jié)果顯示：與對照組相比，0.1、1、2.5μmol/L白藜蘆醇處理6天對hUC-MSCs使細(xì)胞S和G2/M期細(xì)胞增多，G0/G

13、1期細(xì)胞減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。但5和10μmol/L白藜蘆醇處理6天則使細(xì)胞S期細(xì)胞顯著增多，伴隨 G0/G1期細(xì)胞減少（P<0.05）。
　　1.4 Annexin V-FITC/PI染色顯示：與對照組相比，0.1、1、2.5μmol/L白藜蘆醇處理6天使hUC-MSCs凋亡率下降但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而5和10μmol/L白藜蘆醇處理6天則使hUC-MSC凋亡率升高（P<0.05）。

14、　　1.5β-半乳糖苷酶染色顯示：與對照組相比，0.1、1、2.5μmol/L白藜蘆醇處理6天抑制hUC-MSCs衰老（P<0.05），而5或10μmol/L白藜蘆醇處理6天則促進(jìn)衰老（P<0.05）。
　　1.6免疫熒光和qRT-PCR結(jié)果顯示：與對照組相比，0.1、1、2.5、5、10μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理6天均下調(diào)Nestin、NgN1表達(dá)，上調(diào)NSE、βIII-tubulin、Ngn2、Mash1表達(dá)，促進(jìn)hUC-MS

15、Cs向神經(jīng)細(xì)胞分化，并隨濃度增加作用增強(qiáng)（P<0.05）。
　　1.7 Western Blotting結(jié)果顯示：0.1、1、2.5μmol/L白藜蘆醇處理6天上調(diào)hUC-MSCs SIRT1和PCNA表達(dá)，下調(diào)p53和p16的表達(dá)（P<0.05）；而5和10μmol/L起相反作用。0-10μmol/L白藜蘆醇刺激對 p21表達(dá)無顯著差異（P>0.05）。
　　2、體內(nèi)結(jié)果顯示：hUC-MSCs和白藜蘆醇能協(xié)同改善AD小鼠病

16、理，提高學(xué)習(xí)記憶能力功能，調(diào)節(jié)SIRT1信號分子
　　2.1行為學(xué)改變:hUC-MSCs和白藜蘆醇都能改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，表現(xiàn)為：與AD組相比，治療組小鼠到達(dá)平臺的潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增多，目的象限停留時間增長， MSCs+RES組效果最好，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.2免疫組化結(jié)果顯示：與MSCs組相比，RES-MSCs組和MSCs+RES組腦內(nèi)可檢測到更多的移植hUC-MSCs（P<0.05）

17、。
　　2.3病理學(xué)改變：hUC-MSCs和白藜蘆醇協(xié)同減輕AD小鼠腦內(nèi)APP蛋白高表達(dá)（P<0.05），Tau蛋白過磷酸化（P<0.05）和神經(jīng)凋亡，表現(xiàn)為 TUNEL+細(xì)胞減少（P<0.05），MSCs+RES組效果最好，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.4 hUC-MSCs和白藜蘆醇協(xié)同促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)再生，表現(xiàn)為：治療組神經(jīng)再生標(biāo)記物Nestin、βIII-tubulin的表達(dá)增強(qiáng)，MSCs+RES組效

18、果最佳，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）,此結(jié)果可能與 hUC-MSCs和白藜蘆醇協(xié)同上調(diào)海馬內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、NT-3表達(dá)相關(guān)（P<0.05）。
　　2.5 hUC-MSCs和白藜蘆醇協(xié)同調(diào)控海馬部位炎癥細(xì)胞反應(yīng)，表現(xiàn)為：治療組Iba1+小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞減少，GFAP+星形膠質(zhì)細(xì)胞增多，其中MSCs+RES組效果最佳，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而且hUC-MSCs和白藜蘆醇協(xié)同下調(diào)致炎因子 TNF-α、I

19、L-1β表達(dá)，上調(diào)抗炎因子 IL-10的表達(dá)（ P<0.05）, MSCs+RES組改變最大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），此結(jié)果進(jìn)一步證明hUC-MSCs和白藜蘆醇對海馬炎癥的調(diào)節(jié)作用。
　　2.6 hUC-MSCs和白藜蘆醇協(xié)同調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為血清SOD活性升高（P<0.05）和MDA含量下降（P<0.05）, MSCs+RES組差異最顯著（P<0.05）。
　　2.7 hUC-MSCs和白藜蘆醇協(xié)同調(diào)節(jié)腦

20、內(nèi)SIRT1分子信號，表現(xiàn)為：海馬組織中SIRT1、PCNA表達(dá)升高，p53、ac-p53、p21和p16的表達(dá)下降（P<0.05）, MSCs+RES組改變最顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論
　　1、白藜蘆醇對hUC-MSCs的自我更新和神經(jīng)分化具有濃度依賴性作用，低濃度（0.1、1、2.5μmol/L）白藜蘆醇刺激6天可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞衰老、上調(diào)SIRT1和PCNA并下調(diào)p53和 p16表達(dá)

21、下降表達(dá)使活性細(xì)胞增多，對細(xì)胞自我更新產(chǎn)生促進(jìn)作用；而高濃度（5、10μmol/L）白藜蘆醇則通過抑制細(xì)胞增殖、導(dǎo)致S期阻滯、加速細(xì)胞衰老與凋亡，下調(diào)SIRT1和PCNA表達(dá)、上調(diào)p53與p16表達(dá)，導(dǎo)致活性細(xì)胞減少，抑制細(xì)胞自我更新。此外，0.1-10μmol/L白藜蘆醇對 hUC-MSCs神經(jīng)樣分化具有濃度依賴性促進(jìn)作用。白藜蘆醇對hUC-MSCs生物學(xué)特性濃度依賴性調(diào)控對其科研和臨床應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。
　　2、白藜蘆醇促進(jìn)h

22、UC-MSCs在AD小鼠腦內(nèi)的遷移與存活；白藜蘆醇聯(lián)合hUC-MSCs能更有效地降低 APP表達(dá)、Tau磷酸化水平、海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷，改善AD病理狀態(tài)；白藜蘆醇和hUC-MSCs協(xié)同調(diào)節(jié)腦內(nèi)炎癥細(xì)胞與炎性因子；促進(jìn)神經(jīng)生長因子的表達(dá)和海馬神經(jīng)再生；提高AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。白藜蘆醇聯(lián)合hUC-MSCs對有望成為更有效的治療AD的手段，其分子機(jī)制與SIRT1分子信號中 SIRT1、PCNA、ac-p53、p53、p21、p