人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對乳腺癌干細(xì)胞的作用研究.pdf

1、背景：
　　乳腺癌作為現(xiàn)代社會的高發(fā)癌癥，嚴(yán)重威脅著女性的健康。大約有30％的乳腺癌早期患者最終發(fā)展為復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。近年來的研究提出腫瘤干細(xì)胞理論，認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、多向分化、成瘤性高等特點，并且具有放化療引起的凋亡抵抗性以及高侵襲性，不易被常規(guī)治療手段根除，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。因此靶向乳腺癌干細(xì)胞的研究和治療具有重要的意義。
　　干細(xì)胞對于多種實體腫瘤原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶具有靶向性。已有報道基因轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞能有效地靶向性到達(dá)腫瘤

2、組織和其他炎癥部位表達(dá)治療蛋白。由臍帶沃頓膠(Wharton'sjelly)和血管周圍組織中分離出的干細(xì)胞稱為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSC)，具有多向分化和自我更新的潛能，可分化為肌肉細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等，UC-MSC同樣具有對于多種實體腫瘤的靶向性。轉(zhuǎn)染了IFN-β基因的UC-MSC可以通過誘導(dǎo)凋亡而顯著抑制人乳腺癌MDA231細(xì)胞的生長。最近的研究表明，未經(jīng)基因修飾的干細(xì)胞能夠抑制多種腫瘤的生長，如Kaposi’s肉

3、瘤和膠質(zhì)瘤。如果未經(jīng)基因修飾的UC-MSC也能夠抑制腫瘤生長，那么鑒于UC-MSC具有在體外分離擴增容易、來源廣泛、取材方便、免疫源性低、對宿主的不良影響小等優(yōu)勢，UC-MSC將具有更為廣泛的臨床應(yīng)用價值。
　　目的：
　　本研究的總體目標(biāo)是探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSC)對乳腺癌干細(xì)胞(CSC)間的影響及作用機制，為乳腺癌的治療尋找新的靶點和治療策略。具體目標(biāo)包括：
　　1.探討乳腺癌原代組織和乳腺癌細(xì)胞系MC

4、F-7及MDA-MB-231中ESA+CD44+CD24-/low亞群細(xì)胞比例。分析ESA+CD44+CD24-/low亞群細(xì)胞的干性。
　　2.探討hUCMSC在體外對乳腺癌干細(xì)胞的作用及其機制。
　　3.探討hUCMSC在體內(nèi)對乳腺癌干細(xì)胞生長的作用及其機制。
　　方法：
　　1.選擇人乳腺癌原代細(xì)胞及細(xì)胞系MCF-7與MDA-MB-231作為研究對象，進(jìn)行CD44、CD24及ESA標(biāo)記，使用流式儀分選出ES

5、A+CD44+CD24-/low的細(xì)胞亞群，測定ESA+CD44+CD24-/low亞群細(xì)胞及非分選的乳腺癌細(xì)胞的軟瓊脂克隆形成能力。
　　2.在體外通過CellCountingKit-8(CCK8)實驗和軟瓊脂克隆實驗檢測hUCMSC對乳腺癌干細(xì)胞的抑制作用。將各組乳腺癌干細(xì)胞與小數(shù)量的hUCMSC直接共培育后行流式細(xì)胞技術(shù)測定細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，同時行條件培養(yǎng)液實驗。
　　3.以MDA-MB-231乳腺癌干細(xì)胞SCID鼠

6、移植瘤為模型，作體內(nèi)抑瘤實驗。利用免疫組化技術(shù)分析移植瘤中PI3K及AKT的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.MDA-MB-231、MCF-7、原代乳腺癌細(xì)胞中ESA+CD44+CD24-/low表型的細(xì)胞分別占1.83％±0.28％、1.53％±0.16％及0.55％±0.17％。分選后的乳腺癌ESA+CD44+CD24-/low亞群細(xì)胞在軟瓊脂中的克隆形成數(shù)目明顯高于未分選的乳腺癌細(xì)胞(P<0.001)。
　　2.CCK

7、8實驗結(jié)果顯示與hUCMSC共培育的乳腺癌干細(xì)胞的生長受抑制，且抑制作用呈劑量依賴性。乳腺癌干細(xì)胞與軟瓊脂底層的hUCMSC共培育后，克隆體積明顯減小，克隆形成數(shù)明顯低于對照組(p<0.01)。與對照組相比，與hUCMSC共培育和置于hUCMSC條件培養(yǎng)液中的乳腺癌干細(xì)胞的G2-M期細(xì)胞數(shù)增高(p<0.05)，凋亡細(xì)胞數(shù)增加(P<0.01)。
　　3.不同濃度的hUCMSC對SCID小鼠移植瘤的生長均有一定的抑制作用，中等濃度和高

8、濃度hUCMSC組的腫瘤質(zhì)量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；P<0.01)，平均抑瘤率分別達(dá)到21.4％和29.6％。從第11天開始中等濃度和高濃度hUCMSC組生長速度在各時間點上均慢于對照組，并且分別從第21天和第16天開始，中等濃度和高濃度hUCMSC組與對照組相比，腫瘤體積的變化差異有顯著性(P<0.05)。與生理鹽水組相比，各濃度hUCMSC治療組小鼠移植瘤組織中PI3K和AKT蛋白的含量均明顯減少(P<0.0

9、01)。
　　結(jié)論：
　　1.乳腺癌原代組織及乳腺癌細(xì)胞系MCF-7與MDA-MB-231中存在ESA+CD44+CD24-/low亞群細(xì)胞，且MDA-MB-231中ESA+CD44+CD24-/low亞群細(xì)胞含量較高。ESA+CD44+CD24-/low亞群細(xì)胞具有無限自我更新和重建腫瘤特性。
　　2.hUCMSC在體外可明顯抑制乳腺癌干細(xì)胞的增長，其機制可能與阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)。
　　3.hU