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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:體外培養(yǎng)分離純化的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs),觀察其生長(zhǎng)情況及形態(tài),并檢測(cè)其表面標(biāo)志物;探索白藜蘆醇(Resveratrol)在不同濃度下體外定向誘導(dǎo)hUC-MSCs分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的條件及作用;觀察其形態(tài)學(xué)改變,檢測(cè)其基因與蛋白表達(dá)水平;為其將來(lái)參與基礎(chǔ)與臨床治療提供新的理論支持和技術(shù)保證。
方法:取剖宮產(chǎn)健康足月胎兒的
2、臍帶,剔除臍動(dòng)脈和臍靜脈后用D-Hank’s充分沖洗,將獲得的臍帶間質(zhì)組織分為大約1mm3大小的組織塊,用0.2%膠原酶Ⅱ消化,放入含有20%胎牛血清(FBS)、2ng/ml表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、25mM左旋谷氨酰胺(L-Glu)、100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12中培養(yǎng)。觀察獲得的原代細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)趨勢(shì),當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)約80%~90%時(shí),加入0.25%胰酶-1mM EDTA消化細(xì)胞,并傳代。
3、 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)消化細(xì)胞的細(xì)胞表型,包括CD105、CD73、CD90、CD11b、CD45、CD34、CD19以及組織相容性抗原HLA-DR(MHC-II),用抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作為同型對(duì)照。
取原代hUC-MSCs按1:1傳代,記為P1代,倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)變化情況,當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到90%以上時(shí),根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況按1:2或1:3比例進(jìn)行傳代,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
將處于對(duì)數(shù)生
4、長(zhǎng)期增殖迅速的P5代 hUC-MSCs傳代至六孔板及25cm2塑料培養(yǎng)瓶中,使用全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)約70%-80%時(shí),隨機(jī)將1個(gè)六孔板及3個(gè)培養(yǎng)瓶組合為1組,分為四組,前三組作為實(shí)驗(yàn)組,第四組為對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組分別為7.5mg/L、15mg/L、30mg/L的白藜蘆醇(Resveratrol)誘導(dǎo)液,誘導(dǎo)液均用無(wú)血清L-DMEM培養(yǎng)基配制,各組中六孔板每孔含誘導(dǎo)液2ml,每培養(yǎng)瓶中含誘導(dǎo)液4ml,對(duì)照組只加無(wú)血清L-DMEM
5、培養(yǎng)基,將各組置于CO2培養(yǎng)箱(CO25%,37℃)中誘導(dǎo),培養(yǎng)條件同前,繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的形態(tài)變化,并于各組中隨機(jī)選取10個(gè)非重疊視野,拍照記錄視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)及神經(jīng)樣細(xì)胞的數(shù)量,計(jì)算神經(jīng)樣細(xì)胞在視野內(nèi)所占的比例,結(jié)果以X±s表示。四組中誘導(dǎo)于六孔板的細(xì)胞于誘導(dǎo)后第4小時(shí)終止誘導(dǎo),采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)各組細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的表達(dá)情況。然
6、后選取較合適的濃度,使誘導(dǎo)于培養(yǎng)瓶的細(xì)胞分別于誘導(dǎo)后2、4、6、12、24小時(shí)棄去誘導(dǎo)液,用PBS洗滌3次,用Western blot及RT-PCR的方法檢測(cè)各組細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的表達(dá)情況。
結(jié)果:原代hUC-MSCs傳代培養(yǎng)12h后,大多數(shù)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞呈梭形或三角形,隨培養(yǎng)時(shí)間增加,細(xì)胞增殖迅速,貼壁數(shù)量明顯增多,形狀變大,呈長(zhǎng)梭形排列。傳代至第5
7、d可見(jiàn)細(xì)胞呈完全融合狀態(tài),以螺旋狀或放射狀方式排列生長(zhǎng)。此后可以按照1:2或1:3的比例進(jìn)行消化傳代進(jìn)行新一輪的培養(yǎng),如果沒(méi)有傳代并且繼續(xù)培養(yǎng)的活細(xì)胞在貼壁的基礎(chǔ)上會(huì)呈螺旋重疊樣生長(zhǎng),導(dǎo)致局部密度增高。連續(xù)傳代培養(yǎng)多次后仍具有較強(qiáng)的增殖能力。
通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P2、P5及P10代細(xì)胞的細(xì)胞表型,均表達(dá)CD105、CD73及CD90,不表達(dá)CD11b、CD45、CD34、CD19以及組織相容性抗原HLA-DR(MHC-II)。
8、
加入誘導(dǎo)液培養(yǎng),15mg/L組誘導(dǎo)1h后細(xì)胞未見(jiàn)明顯形態(tài)及外觀變化,4h后極個(gè)別細(xì)胞胞體略微收縮,折光性稍顯增強(qiáng),未見(jiàn)突起,并且有少量細(xì)胞脫離瓶壁,但未完全脫離漂浮,6h后胞體收縮的細(xì)胞數(shù)量略顯增多,折光性明顯增強(qiáng),呈橢圓形或類(lèi)圓形,伸出兩條或多條長(zhǎng)短及粗細(xì)不一的細(xì)長(zhǎng)條突起,突起有分支,數(shù)量不等,多數(shù)為雙極細(xì)胞,此時(shí)視野中神經(jīng)樣細(xì)胞比率僅為5%左右。12h時(shí)神經(jīng)樣細(xì)胞未見(jiàn)明顯增多甚至減少,且存在少量漂浮細(xì)胞;30mg/L組誘
9、導(dǎo)1h后神經(jīng)樣細(xì)胞陽(yáng)性率可達(dá)50%,多級(jí)分化細(xì)胞數(shù)量較15mg/L組驟增,細(xì)胞突起及分支更長(zhǎng),數(shù)量更多,各個(gè)細(xì)胞之間借助伸出的突起及其分支相互交織成網(wǎng)狀,4h時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞比例增加至70%左右,僅見(jiàn)極個(gè)別細(xì)胞漂浮,6h后可見(jiàn)神經(jīng)樣細(xì)胞占視野85%-90%,漂浮細(xì)胞較之前稍顯增多,12h后神經(jīng)樣細(xì)胞比率無(wú)明顯增加,且漂浮細(xì)胞數(shù)量增多,24h神經(jīng)樣細(xì)胞比例已經(jīng)降低至70%-80%,漂浮細(xì)胞及未完全脫離瓶底的擺動(dòng)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多;7.5mg/L
10、組與空白對(duì)照組誘導(dǎo)前后相比較無(wú)明顯改變,且7.5mg/L組有少量細(xì)胞漂浮。當(dāng)誘導(dǎo)4h時(shí),免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)結(jié)果為15mg/L組和30mg/L組細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)Nestin和NSE,GFAP為陰性,陽(yáng)性細(xì)胞可見(jiàn)棕黃色的胞體及紫色胞核。30mg/L組細(xì)胞隨時(shí)間誘導(dǎo)的神經(jīng)樣細(xì)胞比率均高于其他組。Western blot及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示各組GFAP的蛋白及mRNA表達(dá)均為陰性。Nestin和NSE的蛋白及mRNA在空白組均有少量表達(dá)
11、,Nestin蛋白及mRNA隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著提升,誘導(dǎo)4h時(shí)最高,之后降低。NSE蛋白及mRNA隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,到6h時(shí)為最高,其后逐漸降低。
結(jié)論:hUC-MSCs從人臍帶中分離純化后能夠在體外穩(wěn)定培養(yǎng)及傳代,并維持較高的活性;傳代培養(yǎng)的hUC-MSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表型CD105、CD73及CD90,不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD11b、CD45、CD34、CD19以及組織相容性抗原HLA-DR(MHC-I
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