白藜蘆醇體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)分離純化的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)，觀察其生長(zhǎng)情況及形態(tài)，并檢測(cè)其表面標(biāo)志物；探索白藜蘆醇（Resveratrol）在不同濃度下體外定向誘導(dǎo)hUC-MSCs分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的條件及作用；觀察其形態(tài)學(xué)改變，檢測(cè)其基因與蛋白表達(dá)水平；為其將來(lái)參與基礎(chǔ)與臨床治療提供新的理論支持和技術(shù)保證。
　　方法：取剖宮產(chǎn)健康足月胎兒的

2、臍帶，剔除臍動(dòng)脈和臍靜脈后用D-Hank’s充分沖洗，將獲得的臍帶間質(zhì)組織分為大約1mm3大小的組織塊，用0.2％膠原酶Ⅱ消化，放入含有20%胎牛血清（FBS）、2ng/ml表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）、25mM左旋谷氨酰胺（L-Glu）、100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12中培養(yǎng)。觀察獲得的原代細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)趨勢(shì)，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)約80%～90%時(shí)，加入0.25%胰酶-1mM EDTA消化細(xì)胞，并傳代。
　

3、　通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)消化細(xì)胞的細(xì)胞表型，包括CD105、CD73、CD90、CD11b、CD45、CD34、CD19以及組織相容性抗原HLA-DR(MHC-II)，用抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作為同型對(duì)照。
　　取原代hUC-MSCs按1:1傳代，記為P1代，倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)變化情況，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到90%以上時(shí)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況按1:2或1:3比例進(jìn)行傳代，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　將處于對(duì)數(shù)生

4、長(zhǎng)期增殖迅速的P5代 hUC-MSCs傳代至六孔板及25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，使用全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)約70%-80%時(shí)，隨機(jī)將1個(gè)六孔板及3個(gè)培養(yǎng)瓶組合為1組，分為四組，前三組作為實(shí)驗(yàn)組，第四組為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別為7.5mg/L、15mg/L、30mg/L的白藜蘆醇（Resveratrol）誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)液均用無(wú)血清L-DMEM培養(yǎng)基配制，各組中六孔板每孔含誘導(dǎo)液2ml，每培養(yǎng)瓶中含誘導(dǎo)液4ml,對(duì)照組只加無(wú)血清L-DMEM

5、培養(yǎng)基，將各組置于CO2培養(yǎng)箱（CO25%，37℃）中誘導(dǎo)，培養(yǎng)條件同前，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，并于各組中隨機(jī)選取10個(gè)非重疊視野，拍照記錄視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)及神經(jīng)樣細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算神經(jīng)樣細(xì)胞在視野內(nèi)所占的比例，結(jié)果以X±s表示。四組中誘導(dǎo)于六孔板的細(xì)胞于誘導(dǎo)后第4小時(shí)終止誘導(dǎo)，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)各組細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP)、巢蛋白（Nestin）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）的表達(dá)情況。然

6、后選取較合適的濃度，使誘導(dǎo)于培養(yǎng)瓶的細(xì)胞分別于誘導(dǎo)后2、4、6、12、24小時(shí)棄去誘導(dǎo)液，用PBS洗滌3次，用Western blot及RT-PCR的方法檢測(cè)各組細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP)、巢蛋白（Nestin）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：原代hUC-MSCs傳代培養(yǎng)12h后，大多數(shù)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形或三角形，隨培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞增殖迅速，貼壁數(shù)量明顯增多，形狀變大，呈長(zhǎng)梭形排列。傳代至第5

7、d可見(jiàn)細(xì)胞呈完全融合狀態(tài)，以螺旋狀或放射狀方式排列生長(zhǎng)。此后可以按照1：2或1：3的比例進(jìn)行消化傳代進(jìn)行新一輪的培養(yǎng)，如果沒(méi)有傳代并且繼續(xù)培養(yǎng)的活細(xì)胞在貼壁的基礎(chǔ)上會(huì)呈螺旋重疊樣生長(zhǎng)，導(dǎo)致局部密度增高。連續(xù)傳代培養(yǎng)多次后仍具有較強(qiáng)的增殖能力。
　　通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P2、P5及P10代細(xì)胞的細(xì)胞表型，均表達(dá)CD105、CD73及CD90，不表達(dá)CD11b、CD45、CD34、CD19以及組織相容性抗原HLA-DR(MHC-II)。

8、
　　加入誘導(dǎo)液培養(yǎng)，15mg/L組誘導(dǎo)1h后細(xì)胞未見(jiàn)明顯形態(tài)及外觀變化，4h后極個(gè)別細(xì)胞胞體略微收縮，折光性稍顯增強(qiáng)，未見(jiàn)突起，并且有少量細(xì)胞脫離瓶壁，但未完全脫離漂浮，6h后胞體收縮的細(xì)胞數(shù)量略顯增多，折光性明顯增強(qiáng)，呈橢圓形或類(lèi)圓形，伸出兩條或多條長(zhǎng)短及粗細(xì)不一的細(xì)長(zhǎng)條突起，突起有分支，數(shù)量不等，多數(shù)為雙極細(xì)胞，此時(shí)視野中神經(jīng)樣細(xì)胞比率僅為5%左右。12h時(shí)神經(jīng)樣細(xì)胞未見(jiàn)明顯增多甚至減少，且存在少量漂浮細(xì)胞；30mg/L組誘

9、導(dǎo)1h后神經(jīng)樣細(xì)胞陽(yáng)性率可達(dá)50%，多級(jí)分化細(xì)胞數(shù)量較15mg/L組驟增，細(xì)胞突起及分支更長(zhǎng)，數(shù)量更多，各個(gè)細(xì)胞之間借助伸出的突起及其分支相互交織成網(wǎng)狀，4h時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞比例增加至70%左右，僅見(jiàn)極個(gè)別細(xì)胞漂浮，6h后可見(jiàn)神經(jīng)樣細(xì)胞占視野85%-90%，漂浮細(xì)胞較之前稍顯增多，12h后神經(jīng)樣細(xì)胞比率無(wú)明顯增加，且漂浮細(xì)胞數(shù)量增多，24h神經(jīng)樣細(xì)胞比例已經(jīng)降低至70%-80%，漂浮細(xì)胞及未完全脫離瓶底的擺動(dòng)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多；7.5mg/L

10、組與空白對(duì)照組誘導(dǎo)前后相比較無(wú)明顯改變，且7.5mg/L組有少量細(xì)胞漂浮。當(dāng)誘導(dǎo)4h時(shí)，免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)結(jié)果為15mg/L組和30mg/L組細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)Nestin和NSE，GFAP為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞可見(jiàn)棕黃色的胞體及紫色胞核。30mg/L組細(xì)胞隨時(shí)間誘導(dǎo)的神經(jīng)樣細(xì)胞比率均高于其他組。Western blot及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示各組GFAP的蛋白及mRNA表達(dá)均為陰性。Nestin和NSE的蛋白及mRNA在空白組均有少量表達(dá)

11、，Nestin蛋白及mRNA隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著提升，誘導(dǎo)4h時(shí)最高，之后降低。NSE蛋白及mRNA隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，到6h時(shí)為最高，其后逐漸降低。
　　結(jié)論：hUC-MSCs從人臍帶中分離純化后能夠在體外穩(wěn)定培養(yǎng)及傳代，并維持較高的活性；傳代培養(yǎng)的hUC-MSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表型CD105、CD73及CD90，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD11b、CD45、CD34、CD19以及組織相容性抗原HLA-DR(MHC-I