人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的:阿爾茨海默病(AD)又稱(chēng)老年癡呆,其主要癥狀是記憶力進(jìn)行性減退,并伴有不同程度的認(rèn)知、語(yǔ)言和人格方面的異常。年齡是AD最主要的危險(xiǎn)因素,70歲后每增加5歲,AD發(fā)生的危險(xiǎn)性增加1倍,80歲后約50％的人有發(fā)生AD的危險(xiǎn)。隨著人類(lèi)平均壽命的延長(zhǎng),世界人口日趨老齡化,老年期癡呆的發(fā)病率也隨之增加。老年癡呆已成為繼心臟病,腫瘤,中風(fēng)后的人類(lèi)第四大殺手。目前研究者已經(jīng)制作出各種阿爾茨海默病動(dòng)物模型,希望能夠找到治療阿爾茨海默病的有效

2、方法。其中主要有自然衰老動(dòng)物模型、Aβ注射動(dòng)物模型、缺氧所致動(dòng)物模型、慢性缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀⒛憠A能損害動(dòng)物模型、鋁中毒動(dòng)物模型等,但是這些動(dòng)物模型只是部分的模擬了阿爾茨海默病的病理變化或者是阿爾茨海默病的癥狀,而且這些動(dòng)物模型價(jià)格昂貴,難飼養(yǎng)易死亡,使其在阿爾茨海默病的研究應(yīng)用中受到了很大的限制。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的最明顯的優(yōu)點(diǎn)是模擬了AD樣神經(jīng)病理學(xué)特征,包括細(xì)胞外Aβ的沉積,營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)炎成分,神經(jīng)膠質(zhì)增生。轉(zhuǎn)基因小鼠可能提供一個(gè)分析Aβ

3、沉積機(jī)制和驗(yàn)證AD的治療效果的較好的動(dòng)物模型。
　　目前老年癡呆的治療主要包括膽堿能藥物、腦細(xì)胞代謝激活劑、腦血循環(huán)促進(jìn)劑、鈣離子拮抗劑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以及抗氧化劑等,但療效均不佳。Zhang等將人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)成具有神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞,在移植入新生鼠大腦后,發(fā)現(xiàn)這些神經(jīng)干細(xì)胞能整合入受體鼠腦,并能分化為3種神經(jīng)細(xì)胞;有文獻(xiàn)將人神經(jīng)干細(xì)胞移植到出生后24個(gè)月的大鼠側(cè)腦室,4周后這些細(xì)胞有序地遷移到

4、大腦皮質(zhì)和海馬,并分化為神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,部分細(xì)胞可和宿主細(xì)胞建立突觸聯(lián)系,并能顯著改善衰老大鼠的認(rèn)知功能。目前,神經(jīng)干細(xì)胞移植已廣泛應(yīng)用于各種神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的實(shí)驗(yàn)研究,應(yīng)用體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子聯(lián)合治療阿爾茨海默病大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的恢復(fù)。骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植治療血管性癡呆也取得了一定的效果。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性較小,可能比較適合于異體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究,但涉及人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞

5、用于老年癡呆的國(guó)內(nèi)外報(bào)道少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)旨在探討人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)阿爾茨海默病的治療作用。
　　方法:①人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、純化、培養(yǎng):無(wú)菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的羊膜,PBS充分沖洗后剪成碎片,用0.25％的胰蛋白酶室溫消化1h,棄去胰蛋白酶,然后用含1.0g/L的膠原酶Ⅳ的DMEM/F12培養(yǎng)液37℃消化2h,制成單細(xì)胞懸液,臺(tái)盤(pán)蘭染色,計(jì)數(shù)活細(xì)胞,以2×105個(gè)/ml接種于75ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。培養(yǎng)基采用VDMEM:VF

6、12=1:1的DMEM/F12加10％的胎牛血清(FBS)、bFGF(終濃度為20ng/ml),將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h后,更換培養(yǎng)液,棄去未貼壁的細(xì)胞,根掘細(xì)胞生長(zhǎng)情況,每3-4天全量換液一次。待細(xì)胞達(dá)到80％-90％融合時(shí),用0.25％的胰酶消化,然后按1:3的比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng),并記為P1代。傳代培養(yǎng)過(guò)程中每3d全量換液,直至貼壁細(xì)胞彼此融合,鋪滿瓶底,再重復(fù)上述操作,傳代

7、培養(yǎng)記為P2代,其余類(lèi)推。②人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定:將人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至第三代,行Nestine免疫細(xì)胞化學(xué)染色。③流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面標(biāo)記:將人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至第三代,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面標(biāo)記CD40、CD80、CD86。④實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:將經(jīng)過(guò)PCR技術(shù)鑒定過(guò)的小鼠分為3組,分別為移植組、對(duì)照組、正常組,移植組為10只APP+小鼠,雌雄各半,給予尾靜脈移植人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞治療;對(duì)照組為10只APP+小鼠,雌雄各半,

8、給予尾靜脈注射生理鹽水;正常組為9只APP-小鼠雌5雄4,未給予任何干預(yù)措施。⑤人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的體外標(biāo)記:待人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至第三代時(shí),移植前,Brdu以3μg/ml終濃度加入hAMSCs細(xì)胞培養(yǎng)瓶37℃、5％CO2飽和濕度孵育箱中孵育24小時(shí)。移植時(shí)生理鹽水洗滌3次,1ml0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞30-60s,短時(shí)低速離心3次(1000prm,5min),去除懸液中的細(xì)胞碎片,用生理鹽水重新懸浮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度1×106

9、/ml備用。⑥人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的尾靜脈移植:在第一輪morris水迷宮評(píng)價(jià)小鼠行為學(xué)情況之后進(jìn)行,將第三代標(biāo)記后的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞制成濃度為1×106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液,用容量為1ml的注射器將體積為0.5ml的細(xì)胞懸液經(jīng)小鼠尾靜脈注入移植組小鼠體內(nèi),注射時(shí)間大于一分鐘,注射完成后留針10秒左右拔針。對(duì)照組小鼠給予注射同體積的生理鹽水,正常組小鼠不給予干預(yù)措施。⑦小鼠空間學(xué)習(xí)能力的測(cè)定(morris水迷宮)定位航行試驗(yàn):試驗(yàn)開(kāi)始前

10、將動(dòng)物放入水池中(不含平臺(tái)),任其自由游泳兩分鐘,以熟悉適應(yīng)迷宮環(huán)境。試驗(yàn)共進(jìn)行兩輪,細(xì)胞移植前和移植15天后各進(jìn)行一輪,每輪試驗(yàn)共歷時(shí)8天,每?jī)商煊?xùn)練1遍,共4遍,每只動(dòng)物每遍訓(xùn)練4次,分別從四個(gè)象限池邊中點(diǎn)面壁放入,4個(gè)放入點(diǎn)隨機(jī)順序。記錄大鼠從入水到找到并爬上平臺(tái)的時(shí)間即逃逸潛伏期。若小鼠鼠在120秒內(nèi)未找到平臺(tái)則由實(shí)驗(yàn)者將其引向平臺(tái),潛伏期記為最高120秒。小鼠找到平臺(tái)后讓其在平臺(tái)上休息30秒后進(jìn)行下一次試驗(yàn)。每只小鼠每訓(xùn)練一遍

11、4次的算術(shù)平均數(shù)即為此小鼠訓(xùn)練一遍的逃逸潛伏期?？臻g探索試驗(yàn):于第9天撤除平臺(tái),隨機(jī)選取兩點(diǎn)先后兩次面壁將小鼠投入水池中,分別攝像記錄小鼠兩次2min內(nèi)水中游泳路徑,用電腦分析計(jì)算小鼠兩次在平臺(tái)象限內(nèi)游泳的時(shí)間的平均值及穿過(guò)原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)的平均值。⑧鼠腦切片染色觀察各組小鼠腦內(nèi)β-淀粉蛋白的表達(dá):分別于第一輪水迷宮測(cè)試前隨機(jī)取模型鼠和正常鼠及細(xì)胞移植后一個(gè)月每實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取小鼠處死,取腦組織冠狀連續(xù)切片行甲醇剛果紅染色觀察三組小鼠腦

12、內(nèi)β-淀粉蛋白的表達(dá)情況。⑨鼠腦切片染色觀察移植組小鼠腦內(nèi)Brdu表達(dá):細(xì)胞移植后一個(gè)月后將移植組小鼠處死,取腦組織蠟塊包埋,冠狀連續(xù)切片免疫組織化學(xué)染色觀察小鼠腦內(nèi)Brdu的表達(dá)。⑩鼠腦切片染色觀察各組小鼠腦內(nèi)GFAP、CHAT的表達(dá):細(xì)胞移植后一個(gè)月將各實(shí)驗(yàn)組小鼠處死,取腦組織冠狀連續(xù)切片行免疫組織化學(xué)染色觀察三組小鼠腦內(nèi)GFAP、CHAT的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:①經(jīng)酶消化從羊膜分離的細(xì)胞于24 h內(nèi)貼壁,72 h細(xì)胞呈圓形、

13、梭形、星形和多角形等多種形態(tài),培養(yǎng)至6-7d,細(xì)胞達(dá)80％~90％融合,呈放射狀或漩渦狀分布;傳代后細(xì)胞3-4d鋪滿瓶底,傳至3代,細(xì)胞形態(tài)很均勻,長(zhǎng)梭形,有偽足。②免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察可見(jiàn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞Nestine表達(dá)陽(yáng)性,胞漿著棕褐色,胞核被染成藍(lán)色。③流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面標(biāo)記:人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞表面較低表達(dá)CD40、CD80、CD86。④在定位航行試驗(yàn)中,移植前移植組與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P>0.05),移植組與正常組之

14、間差異顯著(P<0.05);移植后移植組與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05),移植組與正常組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。探索實(shí)驗(yàn)中,移植前后3組小鼠之間均無(wú)明顯差別(P>0.05)。⑤鼠腦冠狀切片甲醇剛果紅染色可見(jiàn)細(xì)胞移植前,模型鼠腦內(nèi)可見(jiàn)較多斑片樣β-淀粉樣蛋白的沉積,被染成淡粉色,而正常鼠腦內(nèi)則幾乎看不到β-淀粉樣蛋白的沉積;細(xì)胞移植后一個(gè)月,移植組小鼠腦內(nèi)白質(zhì)仍可見(jiàn)較多斑片樣β-淀粉蛋白的沉積,被染成淡粉色,但數(shù)量較對(duì)照組已明

15、顯減少,單個(gè)β-淀粉蛋白團(tuán)塊面積也較對(duì)照組明顯減小,正常組小鼠腦內(nèi)幾乎未見(jiàn)β-淀粉蛋白的沉積。⑥鼠腦冠狀切片Brdu免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)移植組小鼠腦內(nèi)Brdu陽(yáng)性細(xì)胞存在,細(xì)胞核染成棕黃色,胞漿呈淡藍(lán)色,陽(yáng)性細(xì)胞聚集成團(tuán)塊狀,分布未見(jiàn)有規(guī)律性。⑦移植后一個(gè)月,移植組小鼠腦內(nèi)GFAP、CHAT的表達(dá)與正常組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對(duì)照組比較差別亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:①用胰蛋白酶和膠原酶Ⅳ能夠從羊膜分

16、離MSCs,人羊膜MSCs可在含10％FBS和20μg/L bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行體外擴(kuò)增。②Brdu體外標(biāo)記的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)尾靜脈移植給阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)后可以存活,并能遷移至轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)發(fā)揮作用。③人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植可以減少阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白的沉積。④人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療可以改善阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。⑤GFAP、CHAT的表達(dá)的變化可能是人羊膜間充質(zhì)