跨膜型TNF-α介導(dǎo)乳腺癌阿霉素抵抗及分子機(jī)制.pdf

1、TNF-α是一個(gè)具有廣泛生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，以兩種生物活性形式存在，即26kD的跨膜型 (transmembrane TNF-α，tmTNF-α)和17kD的分泌型 (secretedTNF-α，sTNF-α)，后者由TNF-α轉(zhuǎn)化酶(TNF alpha-converting enzyme TACE)酶切tmTNF-α胞外段而形成。兩型TNF-α的分子結(jié)構(gòu)，受體親和力以及作用方式均不同，因此，二者的功能不盡相同。目前，關(guān)于sTNF-α

2、的生物學(xué)功能有大量報(bào)道，而tmTNF-α的生物學(xué)功能卻報(bào)道較少。tmTNF-α不但可與受體結(jié)合，通過正向信號(hào)對靶細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，而且tmTNF-α本身也可作為受體，通過反向信號(hào)對tmTNF-α表達(dá)細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)。
　　 近年來，腫瘤微環(huán)境內(nèi)源性TNF-α作為一種關(guān)鍵性炎癥因子參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展引起廣泛關(guān)注。乳腺癌患者血漿TNF-α升高，且常預(yù)后差。在HER2轉(zhuǎn)基因小鼠中阻斷TNF-α可抑制腫瘤生長。本課題組前期研究證實(shí)導(dǎo)管浸潤

3、性乳腺癌高表達(dá)tmTNF-α，且轉(zhuǎn)染tmTNF-α信號(hào)肽（LS）可使sTNF-α敏感的MCF-7乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟褪苤?，提示tmTNF-α可能通過其反向信號(hào)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抵抗凋亡。那么，tmTNF-α是否也能通過其反向信號(hào)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞抵抗化療呢？如是，其機(jī)制如何？關(guān)于這些問題至今尚未見到相關(guān)報(bào)道。
　　 本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)tmTNF-α與阿霉素耐藥間關(guān)系，并闡明其分子機(jī)制。
　　 通過在體干擾TNF-α表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)

4、證tmTNF-α在乳腺癌中的病理作用及誘導(dǎo)腫瘤耐藥的作用；為提高乳腺癌化療和敏感性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為乳腺癌和其它腫瘤的治療提供新的思路和靶點(diǎn)。
　　 第一部分、tmTNF-α介導(dǎo)乳腺癌阿霉素抵抗及其機(jī)制的體外研究
　　 1．高表達(dá)tmTNF-α乳腺癌細(xì)胞對阿霉素耐藥：用流式檢測證實(shí)MCF-7 幾乎不表達(dá)tmTNF-α，而MDA-MB-231則高表達(dá)tmTNF-α（76％）。給予不同濃度的阿霉素處理48小時(shí)，MTT與DNA片

5、段化結(jié)果顯示不表達(dá)tmTNF-α的MCF-7細(xì)胞對阿霉素敏感，而高表達(dá)tmTNF-α的MDA-MB-231細(xì)胞則對阿霉素誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生抵抗。提示：tmTNF-α可能與乳腺癌細(xì)胞對阿霉素抵抗相關(guān)。
　　 2．抑制TNF-α表達(dá)增強(qiáng)MDA-MB-231 對阿霉素的敏感性：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TNF-αshRNA可使MDA-MB-231tmTNF-α的表達(dá)率從76.3％下降到21.5％，并明顯增加其對阿霉素誘導(dǎo)凋亡的敏感性。提示TNF-α可能導(dǎo)致

6、 MDA-MB-231對阿霉素的耐藥。
　　 3．過表達(dá)TNF-LS降低MCF-7細(xì)胞對阿霉素的敏感性：為排除正向信號(hào)以及sTNF-α的影響，我們穩(wěn)轉(zhuǎn)tmTNF-α信號(hào)肽（leader sequence，LS）于不表達(dá)TNF-α的MCF-7細(xì)胞，結(jié)果使該細(xì)胞由阿霉素的敏感株變?yōu)槟退幹?。提示tmTNF-α通過反向信號(hào)誘導(dǎo)對ADM的耐藥。
　　 4．tmTNF-α介導(dǎo)乳腺癌阿霉素耐藥與MDR1、BCRP和MRP1表達(dá)無關(guān)：<

7、br>　　 ABC 類家族的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子是導(dǎo)致ADM耐藥最常見的原因之一。我們采用Real-time PCR發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TNF-LS或干擾tmTNF-α的表達(dá)，對兩株乳腺癌細(xì)胞耐藥基因MDR1、BCRP和MRP1的mRNA 水平無影響；同樣，阿霉素處理也未見明顯改變（p>0.05）。我們應(yīng)用FCM證實(shí)MDR1的蛋白水平與其轉(zhuǎn)錄水平一樣，未見明顯改變。上述結(jié)果提示tmTNF-α介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥可能與上述耐藥基因的表達(dá)無關(guān)。<

8、br>　　 5．tmTNF-α不影響乳腺癌細(xì)胞表達(dá)HER2：因?yàn)镠ER2過表達(dá)是促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和化療抵抗的重要分子，我們應(yīng)用FCM證實(shí)：轉(zhuǎn)染TNF-LS對MCF-7表達(dá)HER2無影響，且阿霉素處理后無明顯改變，提示HER2表達(dá)可能不受tmTNF-α的影響。
　　 6．ERK 信號(hào)通路參與tmTNF-α介導(dǎo)乳腺癌阿霉素耐藥：ERK1/2是常見的促生存而導(dǎo)致化療耐藥的信號(hào)途徑之一。用WB方法證實(shí)MCF-7轉(zhuǎn)染TNF-LS可促進(jìn)

9、ERK1/2組成性磷酸化。下調(diào)tmTNF-α后可抑制 MDA-MB-231ERK1/2組成性磷酸化；用ERK1/2 抑制劑PD8059可拮抗tmTNF-α反向信號(hào)的作用，逆轉(zhuǎn)MCF-7/TNF-LS和MDA-MB-231對阿霉素的敏感性。提示ERK1/2信號(hào)通路參與tmTNF-α介導(dǎo)乳腺癌阿霉素耐藥。
　　 7．NF-κB信號(hào)通路參與tmTNF-α介導(dǎo)乳腺癌阿霉素耐藥：NF-κB也是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥的重要途徑之一。用ELISA和

10、WB證實(shí)：轉(zhuǎn)染TNF-LS可促進(jìn)MCF-7的IκB降解和NF-κB組成性活化。下調(diào)tmTNF-α可抑制 MDA-MB-231的IκB降解和NF-κB組成性活化。NF-κB特異性抑制劑BAY118072可拮抗tmTNF-α反向信號(hào)的作用，逆轉(zhuǎn)MCF-7/TNF-LS和MDA-MB-231對阿霉素的敏感性。提示NF-κB信號(hào)通路參與tmTNF-α介導(dǎo)乳腺癌阿霉素耐藥。
　　 8．抗凋亡基因IAP 家族與BCL2家族基因參與tmTNF

11、-α介導(dǎo)乳腺癌阿霉素耐藥：我們應(yīng)用Real-time PCR與Western blot證實(shí)：MCF-7/TNF-LS和MDA-MB-231抗凋亡分子BCL-xl、cIAP1、xIAP組成性表達(dá)增加，而促凋亡分子BAX基因轉(zhuǎn)錄則減少。提示tmTNF-α可能通過NF-κB促進(jìn)抗凋亡分子表達(dá)，并阻斷阿霉素誘導(dǎo)的促凋亡分子BAX基因轉(zhuǎn)錄，從而抵抗阿霉素耐藥。
　　 第二部分、tmTNF-α介導(dǎo)乳腺癌阿霉素抵抗的體內(nèi)研究
　　 1

12、．干擾tmTNF-α表達(dá)對MDA-MB-231體內(nèi)成瘤率影響：我們將高表達(dá)tmTNF-α的MDA-MB-231親本細(xì)胞與穩(wěn)轉(zhuǎn)TNF-αshRNA的MDA-MB-231接種于裸鼠，結(jié)果顯示：親本細(xì)胞100％成瘤率需10天，干擾tmTNF-α（干擾率約為80％）100％成瘤率需20天，提示干擾TNF-α基因表達(dá)后，MDA-MB-231的成瘤時(shí)間明顯延長。
　　 2．干擾tmTNF-α表達(dá)聯(lián)合阿霉素處理抑制裸鼠移植瘤的生長：我們利用上

13、述動(dòng)物模型，待移植瘤長至約100mm3時(shí)，開始用4mg/kg阿霉素腹腔注射干預(yù)3周。結(jié)果顯示：單獨(dú)TNF-α干擾組的腫瘤體積明顯比對照組小（p<0.05），腫瘤抑制率約為26％，提示干擾TNF-α表達(dá)即可抑制MDA-MB-231移植瘤的生長。
　　 當(dāng)聯(lián)合阿霉素處理時(shí)，其腫瘤體積變小更加明顯，其抑瘤率為61％，提示干預(yù)tmTNF-α表達(dá)可以顯著提高體內(nèi)阿霉素的治療效果。
　　 3．干擾tmTNF-α表達(dá)聯(lián)合阿霉素處理促進(jìn)

14、裸鼠移植瘤的凋亡：阿霉素主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗瘤作用。我們應(yīng)用Caspase 3酶活性檢測細(xì)胞凋亡，證實(shí)：單獨(dú)干擾tmTNF-α表達(dá)對Caspase 3酶活性無影響，當(dāng)與阿霉素聯(lián)合處理時(shí)，Caspase 3酶活性明顯增加 (p<0.05)。提示干擾tmTNF-α表達(dá)可促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而提高化療作用。
　　 4．干擾tmTNF-α表達(dá)聯(lián)合阿霉素處理對裸鼠生存時(shí)間的影響：我們用干擾tmTNF-α表達(dá)聯(lián)合阿霉素處理，

15、對荷瘤裸鼠生存時(shí)間進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示：高表達(dá)tmTNF-α的乳腺癌荷瘤動(dòng)物生存時(shí)間最短，其中位生存期為31天，穩(wěn)轉(zhuǎn)TNF-αshRNA組則為41.5天，而聯(lián)合阿霉素處理后其中位生存期為60.5天，生存時(shí)間明顯延長（p<0.05），提示干擾tmTNF-α表達(dá)聯(lián)合阿霉素處理可以明顯延長荷瘤裸鼠的生存時(shí)間。
　　 綜上所述，TNF-α可通過其反向信號(hào)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞對阿霉素藥耐藥，其主要機(jī)制是通過組成性激活促生存途徑ERK1/2和NF-