山羊痘病毒P32基因跨膜區(qū)缺失載體的構(gòu)建與表達.pdf

1、本課題首先建立了羊痘與羊口瘡二重PCR診斷方法，試驗表明該方法特異性強、敏感性高，可檢測到4pg的DNA模板，能很好區(qū)分癥狀相似的山羊痘和羊口瘡，本試驗檢測了7份疑似山羊痘病料，檢出山羊痘陽性6份，羊口瘡陽性1份。對廣西山羊痘6份陽性病料和國內(nèi)現(xiàn)用的山羊痘疫苗株的p32蛋白的全基因進行了PCR擴增、克隆和測序，并將序列上傳至Genbank中(序列號分別是EF522176、EF522177、EF522178、EF522179、EF5221

2、80、EF522181)．序列分析結(jié)果表明，廣西分離株之間的核苷酸同源性99.4-100％，推導的氨基酸同源性為98.1-99.7％，山羊痘廣西分離株與哈薩克斯坦AY077835、 NC004003以及印度的AY382369、AY159333和中國哈爾濱的AY881707分離株的核苷酸同源性為99.6-99.9％，推導的氨基酸同源性為98.8-99.7％；與國內(nèi)使用的疫苗株的核苷酸同源性為99.3-99.8％，推導的氨基酸同源性為97.

3、8-99.4％；廣西分離株、哈薩克斯坦的AY077835、NC004003，印度的 AY382369、AY159333和中國哈爾濱的AY881707與現(xiàn)用的疫苗株相比，在34-35位都缺失了2個氨基酸；廣西分離株核苷酸6151位的堿基全部由T變?yōu)镃，647-652位核苷酸構(gòu)成由TGTATA變異為TGTACA，多了1個限制性內(nèi)切酶Bsp1407I位點，而疫苗株和國內(nèi)及國外的AY077835、NC004003、AY382369、 AY159

4、333、AY881707在647-652位核苷酸都沒有該限制性內(nèi)切酶酶切位點，因此用限制性內(nèi)切酶Bsp1407I可以區(qū)分疫苗株與廣西分離株，本文建立了PCR-RFLP方法，疫苗株可以切成135bp和604bp兩個片段，廣西分離株可以切成135bp、226bp和378bp三個片段。為了進一步研究P32基因，本研究利用重組PCR技術(shù)消除P32基因跨膜區(qū)，用DNAstar軟件對跨膜區(qū)缺失前后的蛋白圖譜分析可知，跨膜區(qū)缺失前后的蛋白跨膜區(qū)位置的

5、折疊構(gòu)象、螺旋發(fā)生了一定變化，但抗原性在缺失前后未見變化，因此構(gòu)建了一個缺失片段的重組質(zhì)粒pGEX-S6，把該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG誘導進行原核表達，經(jīng)SDS-PAGE檢測表達產(chǎn)物，結(jié)果顯示檢測到P32基因的表達產(chǎn)物，用BandScan軟件對表達產(chǎn)物分析，優(yōu)化反應(yīng)條件，最佳誘導時間為5h，IPTG最佳誘導濃度是0.8mmol/I，最佳誘導溫度是37℃，優(yōu)化后表達的蛋白占菌體蛋白的29.4％，表達產(chǎn)物以融合蛋