ω-3脂肪酸可調(diào)控的跨膜型TNFα表達(dá)載體的構(gòu)建及其抗癌效應(yīng)研究.pdf

1、該研究首先構(gòu)建帶有PPRE-tk啟動(dòng)子片段的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)報(bào)告基因載體,證明了通過這個(gè)特異的啟動(dòng)子片段,ω-3PUFA可以誘導(dǎo)下游靶基因高效表達(dá),并呈一定的時(shí)間、劑量依賴關(guān)系.在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建帶有相同PPRE調(diào)控元件的tmTNFα真核表達(dá)載體,以人白血病HL-60細(xì)胞和乳腺癌MCF-7細(xì)胞為研究對象,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組載體的腫瘤細(xì)胞株,應(yīng)用RT-PCR和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測ω-3PUFA對轉(zhuǎn)染細(xì)胞外源性tmTNFα

2、表達(dá)的調(diào)控.主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下:1.運(yùn)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建帶有PPRE-tk調(diào)控元件的tmTNFα真核表達(dá)載體,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HL-60和MCF-7細(xì)胞株.經(jīng)RT-PCR和熒光免疫細(xì)胞化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的外源性tmTNFα基因產(chǎn)物定位于細(xì)胞膜,經(jīng)ω-3PUFA處理后mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加,呈一定的時(shí)間、劑量依賴關(guān)系,說明ω-3PUFA可調(diào)控的tmRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建成功.2.pPPRE-tmTNFα轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的HL-6

3、0和MCF-7細(xì)胞經(jīng)ω-3PUFA處理后,增殖功能均受抑制,其中HL-60細(xì)胞周期被阻滯在G<,0>/G<,1>期、細(xì)胞凋亡率增加、可檢測到DNA梯形帶,轉(zhuǎn)染細(xì)胞上述變化更為顯著.ω-3PUFA對MCF-7細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡率未見明顯影響,而轉(zhuǎn)染pPPRE-tmTNFα的MCR-7細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡事件,經(jīng)ω-3PUFA處理后凋亡效應(yīng)更為顯著.這些結(jié)果說明ω-3PUFA協(xié)同外源性tmTNFα基因產(chǎn)物可以更為有效的抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)

4、細(xì)胞凋亡.3.pPPRE-tmTNFα轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的HL-60細(xì)胞經(jīng)ω-3PUFA處理后,可見細(xì)胞caspase-1、3、8和9mRNA和蛋白表達(dá)增加,caspase-8活性增高,轉(zhuǎn)染細(xì)胞上述變化更為明顯.ω-3PUFA對MCF-7細(xì)胞caspase表達(dá)和活性未見明顯影響;轉(zhuǎn)染pPPRE-tmTNFα的MCF-7細(xì)胞可以檢測到caspase-8活性的增強(qiáng),經(jīng)ω-3PUFA處理后caspase-1、8和9表達(dá)和活性明顯增加(MCF-7細(xì)胞

5、缺失caspase-3),調(diào)亡效應(yīng)更為顯著,應(yīng)用caspase抑制劑能部分拮抗ω-3PUFA和/或tmTNFα對腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡和抑制增殖的作用.以上結(jié)果說明caspase途徑在ω-3PUFA和/或tmTNFα誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡中可能發(fā)揮重要作用,根據(jù)caspase凋亡機(jī)制的不同,推測TNFR介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)和線粒體依賴的凋亡途徑可能是ω-3PUFA協(xié)同tmTNFα誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的主要相關(guān)機(jī)制.綜上所述,ω-3PUFA協(xié)同外源性tm