AChR-IgG Fc段融合蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、重癥肌無力（myastheniagravis，MG）是一種典型的抗體介導(dǎo)、補體參與的器官特異性自身免疫性疾病，煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinicAcetylcholinereceptor，nAChR）抗體是其發(fā)病的重要效應(yīng)因子。臨床表現(xiàn)主要為橫紋肌無力，嚴(yán)重時可累及呼吸肌，危及生命。
　　現(xiàn)有治療手段主要為膽堿酯酶抑制劑、皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、血漿置換、靜脈注射免疫球蛋白、胸腺切除術(shù)等，能一定程度控制病情，但不能抑制病程發(fā)展，

2、且會影響全身免疫系統(tǒng)。致病性B細(xì)胞分泌產(chǎn)生AChR抗體，是MG發(fā)病的關(guān)鍵因子，若能從源頭上清除這類B細(xì)胞則有望控制MG病情。
　　本研究希望通過真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHOk1細(xì)胞以獲得一種AChRIgG‐Fc融合蛋白，該融合蛋白可與分泌AChR抗體的致病B細(xì)胞表面抑制性受體FcγRBⅡ或單核‐巨噬細(xì)胞表面的Fcγ受體特異性結(jié)合，抑制B細(xì)胞活化并促進其凋亡。
　　以人nAChRα1亞基全序列為模板，以PCR法擴增AChRα1亞基胞

3、外段主要免疫區(qū)基因片段Hα1-121，將其插入真核表達(dá)載體pAN1782。將構(gòu)建的新載體轉(zhuǎn)染至CHOk1細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)AChRIgGFc‐融合蛋白的CHOk1細(xì)胞株，以Westernblot法檢測AChRIgGFc‐融合蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果顯示Hα1-121經(jīng)PCR法擴增后所獲428bp基因片段大小符合預(yù)計結(jié)果，測序所得核苷酸序列與人類基因庫中AChRα1亞基胞外段基因片段Hα1-121序列完全一致，未出現(xiàn)點突變或移碼突變。所

4、構(gòu)建的新載體經(jīng)酶切鑒定證實片段插入正確，載體構(gòu)建成功。Westernblot法檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染新載體的CHOk1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中有AChRIgGFc‐融合蛋白表達(dá)。
　　綜上所述，成功構(gòu)建人AChRIgGFc‐段融合蛋白真核表達(dá)載體，且該融合蛋白可在轉(zhuǎn)染新載體的CHOk1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，為下一步靶向B細(xì)胞治療重癥肌無力奠定了初步基礎(chǔ)。
　　EAMG是MG的動物模型，是研究MG發(fā)病機制、治療策略的重要手段。我們采用重組表達(dá)的人