HIV-1膜融合抑制劑的原核表達、純化及真核載體的構(gòu)建和活性檢測.pdf

1、人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是引起獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)的病原體。依據(jù)病毒外殼是否包裹有富含脂質(zhì)的膜，可將病毒分為無囊膜病毒和囊膜病毒兩類，HIV屬于囊膜病毒。囊膜病毒只有在病毒囊膜和靶細胞膜融合之后才能將其遺傳物質(zhì)釋放注入靶細胞，達到侵染靶細胞的目的。膜融合主要是由囊膜上的融合蛋白介導完成的，根據(jù)蛋

2、白的結(jié)構(gòu)特點，囊膜病毒的融合蛋白可分為兩類：Ⅰ類融合蛋白和Ⅱ類融合蛋白。Ⅰ類融合蛋白在跨膜亞單位上有兩段高度保守的七肽重復序列，一個靠近N端，稱為HR1、HR-A或N-peptide；另一個靠近C端，稱為HR2、HR-B或C-peptide。這兩段七肽重復序列與融合蛋白的構(gòu)象變化緊密相關(guān)，晶體結(jié)構(gòu)學研究表明這兩段七肽重復序列能夠形成發(fā)卡三聚體結(jié)構(gòu)(或稱六螺旋束結(jié)構(gòu))，被認為是Ⅰ類融合蛋白膜融合后構(gòu)象的核心結(jié)構(gòu)。在發(fā)卡三聚體結(jié)構(gòu)中，三個螺

3、旋狀的C-peptides以反向平行的方式結(jié)合在由三個N-peptides所形成的中心三聚體結(jié)構(gòu)的周圍，每一個C-peptide結(jié)合在由兩個N-peptides所形成的保守疏水溝槽中。經(jīng)證實C-peptides通過結(jié)合到N-peptide區(qū)以優(yōu)勢競爭的方式抑制發(fā)卡三聚體的形成，從而阻斷膜融合；同樣N-peptides也可通過結(jié)合到C-peptide區(qū)從而阻斷膜融合。人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)的囊膜蛋白即為Ⅰ類融合蛋白。 已

4、證實HIV-1的N肽(HR1)和C肽(HR2)都具有融合抑制活性。目前HIV-1的HR2多肽T-20已通過美國食品和藥物檢驗局批準，成為第一個抗艾滋病的膜融合抑制劑。還有許多基于HIV膜融合這一機制設(shè)計的類似抑制劑也處于研究階段，但是實驗結(jié)果表明C肽的穩(wěn)定性及膜融合抑制活性要優(yōu)于N肽，這可能是由于在缺乏C肽的情況下，N肽非常容易自身聚集，從而失去了與靶序列結(jié)合的能力。由于直接衍生于HR1的N肽水溶性差、容易聚集、難以發(fā)揮作用，因此C肽是

5、目前最有前景的抗HIV融合抑制劑。 本實驗室前期工作者用HR1基因和HR2基因分別構(gòu)建了三種HIV-1膜融合抑制劑HR212(HR2-HR1-HR2)、HR121(HR1-HR2-HR1)和5-Helix(HR1-HR2-HR1-HR2-HR1)，并將其構(gòu)建在原核表達載體pGEX-6p-1中。本實驗對這三種蛋白進行了原核表達及純化，結(jié)果表明它們均可在大腸桿菌中可溶表達，用親和層析和凝膠過濾可得到高純度目的蛋白；體外膜融合抑制實驗

6、證明它們均可抑制HIV-1假病毒發(fā)生膜融合，HR212、5-Helix和HR121蛋白的半數(shù)抑制濃度分別為2.8±0.63nM、13±3nM和16.2±2.8nM，其中HR212的膜融合抑制活性最高，因此與同類抑制劑相比較，HR212理論上可以作為理想的新一代膜融合抑制劑對AIDS患者進行治療。但是目前抗艾滋病的融合抑制劑多為多肽形式，由于多肽類藥物本身存在的一些缺陷，如不能口服及制備工藝復雜、成本高等，人們希望找到與肽類效果相當而又克

7、服其缺陷的其他形式抗HIV藥物。所以在研究HR212蛋白形式的同時，本實驗又進一步將HR212基因構(gòu)建在真核表達載體pcDNA3.0上，以期HR212可以在DNA水平上發(fā)揮膜融合抑制活性。本實驗首先將HR212基因構(gòu)建在真核表達載體pcDNA3.0上得到重組載體pcDNA3.0-HR212-c-myc和pcDNA3.0-HR212，然后將重組載體pcDNA3.0-HR21.2-c-myc轉(zhuǎn)染哺乳動物真核細胞HepG2，分別進行weste

8、rn blotting分析和細胞分泌阻斷實驗，結(jié)果表明HR212可在真核細胞HepG2中分泌表達；構(gòu)建沒有c-myc標簽的pcDNA3.0-HR212重組載體，目的是檢測c-myc標簽蛋白是否對目的蛋白HR212在真核細胞內(nèi)的表達、折疊、轉(zhuǎn)運、活性等產(chǎn)生影響，試驗結(jié)果證明pcDNA3.0-HR212質(zhì)粒的融合抑制活性高于pcDNA3.0-HR212-c-myc，說明c-myc標簽蛋白對HR212活性有一定影響，但未完全抑制；細胞融合抑制