HIV-1膜融合抑制劑的原核表達、純化及真核載體的構建和活性檢測.pdf

1、人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是引起獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)的病原體。依據(jù)病毒外殼是否包裹有富含脂質的膜，可將病毒分為無囊膜病毒和囊膜病毒兩類，HIV屬于囊膜病毒。囊膜病毒只有在病毒囊膜和靶細胞膜融合之后才能將其遺傳物質釋放注入靶細胞，達到侵染靶細胞的目的。膜融合主要是由囊膜上的融合蛋白介導完成的，根據(jù)蛋

2、白的結構特點，囊膜病毒的融合蛋白可分為兩類：Ⅰ類融合蛋白和Ⅱ類融合蛋白。Ⅰ類融合蛋白在跨膜亞單位上有兩段高度保守的七肽重復序列，一個靠近N端，稱為HR1、HR-A或N-peptide；另一個靠近C端，稱為HR2、HR-B或C-peptide。這兩段七肽重復序列與融合蛋白的構象變化緊密相關，晶體結構學研究表明這兩段七肽重復序列能夠形成發(fā)卡三聚體結構(或稱六螺旋束結構)，被認為是Ⅰ類融合蛋白膜融合后構象的核心結構。在發(fā)卡三聚體結構中，三個螺

3、旋狀的C-peptides以反向平行的方式結合在由三個N-peptides所形成的中心三聚體結構的周圍，每一個C-peptide結合在由兩個N-peptides所形成的保守疏水溝槽中。經證實C-peptides通過結合到N-peptide區(qū)以優(yōu)勢競爭的方式抑制發(fā)卡三聚體的形成，從而阻斷膜融合；同樣N-peptides也可通過結合到C-peptide區(qū)從而阻斷膜融合。人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)的囊膜蛋白即為Ⅰ類融合蛋白。 已

4、證實HIV-1的N肽(HR1)和C肽(HR2)都具有融合抑制活性。目前HIV-1的HR2多肽T-20已通過美國食品和藥物檢驗局批準，成為第一個抗艾滋病的膜融合抑制劑。還有許多基于HIV膜融合這一機制設計的類似抑制劑也處于研究階段，但是實驗結果表明C肽的穩(wěn)定性及膜融合抑制活性要優(yōu)于N肽，這可能是由于在缺乏C肽的情況下，N肽非常容易自身聚集，從而失去了與靶序列結合的能力。由于直接衍生于HR1的N肽水溶性差、容易聚集、難以發(fā)揮作用，因此C肽是

5、目前最有前景的抗HIV融合抑制劑。 本實驗室前期工作者用HR1基因和HR2基因分別構建了三種HIV-1膜融合抑制劑HR212(HR2-HR1-HR2)、HR121(HR1-HR2-HR1)和5-Helix(HR1-HR2-HR1-HR2-HR1)，并將其構建在原核表達載體pGEX-6p-1中。本實驗對這三種蛋白進行了原核表達及純化，結果表明它們均可在大腸桿菌中可溶表達，用親和層析和凝膠過濾可得到高純度目的蛋白；體外膜融合抑制實驗

6、證明它們均可抑制HIV-1假病毒發(fā)生膜融合，HR212、5-Helix和HR121蛋白的半數(shù)抑制濃度分別為2.8±0.63nM、13±3nM和16.2±2.8nM，其中HR212的膜融合抑制活性最高，因此與同類抑制劑相比較，HR212理論上可以作為理想的新一代膜融合抑制劑對AIDS患者進行治療。但是目前抗艾滋病的融合抑制劑多為多肽形式，由于多肽類藥物本身存在的一些缺陷，如不能口服及制備工藝復雜、成本高等，人們希望找到與肽類效果相當而又克

7、服其缺陷的其他形式抗HIV藥物。所以在研究HR212蛋白形式的同時，本實驗又進一步將HR212基因構建在真核表達載體pcDNA3.0上，以期HR212可以在DNA水平上發(fā)揮膜融合抑制活性。本實驗首先將HR212基因構建在真核表達載體pcDNA3.0上得到重組載體pcDNA3.0-HR212-c-myc和pcDNA3.0-HR212，然后將重組載體pcDNA3.0-HR21.2-c-myc轉染哺乳動物真核細胞HepG2，分別進行weste

8、rn blotting分析和細胞分泌阻斷實驗，結果表明HR212可在真核細胞HepG2中分泌表達；構建沒有c-myc標簽的pcDNA3.0-HR212重組載體，目的是檢測c-myc標簽蛋白是否對目的蛋白HR212在真核細胞內的表達、折疊、轉運、活性等產生影響，試驗結果證明pcDNA3.0-HR212質粒的融合抑制活性高于pcDNA3.0-HR212-c-myc，說明c-myc標簽蛋白對HR212活性有一定影響，但未完全抑制；細胞融合抑制