長(zhǎng)鏈非編碼RNA PVT1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-152參與肝纖維化的研究.pdf

1、目的:肝纖維化主要特征為肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的過(guò)度沉積。肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell，HSC)是肝主要的ECM產(chǎn)生細(xì)胞，其活化過(guò)程被視為肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近來(lái)研究顯示Hedgehog(Hh)調(diào)控的內(nèi)皮間葉化進(jìn)程(EMT)參與HSC活化。以往視為“噪音”的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Longnon-codingRNAs，lncRNAs)現(xiàn)已被證實(shí)與多種疾病相關(guān)且能調(diào)節(jié)基因功能

2、。漿細(xì)胞瘤變異易位1(Plasmacytoma varianttranslocation1，PVT1)是一個(gè)腫瘤相關(guān)lncRNA，但其在肝纖維化中的作用尚不清楚。本研究目的是探索PVT1在肝纖維化中的表達(dá)改變、功能及其相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型接受重組腺病毒Ad-shPVT1或丹酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)的治療并檢測(cè)肝臟膠原量的改變。原代HSCs接受PVT1

3、siRNA或Sal B處理后檢測(cè)增殖和膠原改變。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot分別檢測(cè)EMT、Hedgehog信號(hào)及其它相關(guān)基因mRNA和蛋白改變。亞硫酸氫鹽測(cè)序法用于分析PTCH1啟動(dòng)子甲基化。熒光素報(bào)告基團(tuán)及Pull down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PVT1和microRNA-152（miR-152）間是否存在關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)果:與對(duì)照組相比，PVT1在纖維化肝組織和活化的HSCs中表達(dá)升高。在HSCs中，沉默PVT1有效抑制HS

4、C活化包括增殖和膠原蛋白的下降;體內(nèi)PVT1的減少也能抑制CCl4誘導(dǎo)的I型膠原。PVT1下降引起EMT進(jìn)程的阻滯，伴有E-cadherin的上調(diào)和desmin及vimentin的下調(diào)。PVT1下降也抑制了Hedgehog信號(hào)，伴有PTCH1的上調(diào)和SMO及GLI2的下調(diào)。此外，我們的研究表明Sal B也有良好的體內(nèi)外抗肝纖維化療效。在Sal B處理后的HSCs中，再次確證了Hedgehog信號(hào)下降會(huì)伴有EMT進(jìn)程阻滯。研究發(fā)現(xiàn)作為He

5、dgehog信號(hào)負(fù)向調(diào)控因子的PTCH1，其啟動(dòng)子在肝纖維化進(jìn)展時(shí)會(huì)高度甲基化。SalB能抑制PTCH1的甲基化并恢復(fù)其表達(dá)水平。深入研究證實(shí)靶向DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1的miR-152調(diào)控PTCH1甲基化進(jìn)程。發(fā)現(xiàn)PVT1下調(diào)不僅抑制體內(nèi)外PCTH1的甲基化還伴有miR-152的升高。值得注意的是，下降的細(xì)胞增殖和膠原表達(dá)以及增強(qiáng)的PTCH1去甲基化和PTCH1表達(dá)水平，這些PVT1下調(diào)所帶來(lái)的效應(yīng)均被miR-152抑制劑所阻斷。熒光素報(bào)告

6、基團(tuán)實(shí)驗(yàn)證實(shí)PVT1與miR-152間存在靶向關(guān)系。Pull down實(shí)驗(yàn)也證實(shí)PVT1能夠直接結(jié)合miR-152。此外，在Sal B處理后的HSCs中沉默PVT1能增強(qiáng)Sal B對(duì)細(xì)胞增殖和膠原的抑制作用。
　　結(jié)論:PVT1在CCl4誘導(dǎo)后的纖維化肝組織和活化的HSCs中表達(dá)均上調(diào)，而PVT1下調(diào)后則表現(xiàn)出體內(nèi)外抗纖維化效果。證實(shí)PVT1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-152繼而表觀性抑制PTCH1表達(dá)，從而促進(jìn)肝纖維化中Hedgeho