長鏈非編碼RNA PTENP1對PTEN基因表達(dá)的影響.pdf

1、背景：目前我國人口的前五位死因是惡性腫瘤、腦血管病、呼吸系統(tǒng)病、心臟病、損傷和中毒。隨著發(fā)病率和死亡率的不斷變化，癌癥已經(jīng)成為中國人群死亡的首要原因。根據(jù)我國全國腫瘤登記中心的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)報(bào)告顯示：中國2015年預(yù)計(jì)有429萬癌癥新發(fā)病例，281萬癌癥死亡病例。因此，研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的診斷方法及靶向位點(diǎn)，對于改善人類生存質(zhì)量、提高生存率尤為重要。惡性腫瘤的發(fā)生過程及其復(fù)雜，需要多種基因、多種分子、多種因素、參與到多個(gè)步驟及階段。相

2、關(guān)研究已證實(shí)，某些抑癌基因的突變是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的最常見的分子改變。起初認(rèn)為長鏈非編碼RNA不具有生物學(xué)功能。近期大量研究發(fā)現(xiàn)，多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程均有LncRNAs的參與。目前已證實(shí)，多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有PTEN基因的的突變。 PTEN主要通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路等發(fā)揮作用。長鏈非編碼RNA PTENP1與PTEN存在高度同源性，其高度同源區(qū)域位于PTENP1的3’非編碼區(qū)與PTEN的3’非編碼區(qū)，該區(qū)域是micRNA高

3、度聚集區(qū)。相關(guān)研究表明在一些惡性腫瘤細(xì)胞系中如乳腺癌、前列腺癌，某些micRNA既可以靶向結(jié)合PTENP1又可以靶向結(jié)合PTEN。即PTENP1可以通過競爭性靶向結(jié)合micRNAs來調(diào)節(jié)PTEN基因的表達(dá)。但具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)選擇HEK293T細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，該細(xì)胞由293細(xì)胞派生而來。該細(xì)胞具有永生化的特點(diǎn)，永生化是細(xì)胞惡變的必經(jīng)階段。
　　目的：通過過表達(dá)PTENP1和PTEN同源區(qū)域，從基因水平和蛋白水平檢測PTEN

4、基因的表達(dá)情況及PI3K/AKT信號通路中重要分子的表達(dá)情況，從而探討PTENP1調(diào)節(jié)PTEN基因表達(dá)的機(jī)制。
　　方法：⑴選擇HEK293T細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，應(yīng)用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。⑵將含有PTENP1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中擴(kuò)增。選擇氨芐青霉素做篩選，選出陽性克隆，搖菌，提取質(zhì)粒，酶切，送測序。測序結(jié)果正確后，將酶切片段與pcDNA3.1（+）鏈接，擴(kuò)增，無內(nèi)毒素質(zhì)粒盒提取，獲得大量質(zhì)粒，-80℃保存。⑶實(shí)驗(yàn)分組：將生長狀態(tài)

5、良好的HEK293T細(xì)胞分為3組：正常對照組（A組）、空質(zhì)粒組（B組）、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-PTENP1質(zhì)粒組（C組）。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒 Lipofectamin2000操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)，評價(jià)轉(zhuǎn)染效果。⑷使用Trizol試劑提取三組細(xì)胞中的總RNA，RT-PCR檢測其PTEN基因擴(kuò)增情況。⑸Western Blot法檢測三組細(xì)胞中PTEN基因的表達(dá)情況，及PI3K/AKT信號通路中PI3K、p-PI3

6、K、AKT、p-AKT的表達(dá)情況。⑹得到的所有原始數(shù)據(jù)以均值+標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS Statistics進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果P<0.05認(rèn)為結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①通過PCR等實(shí)驗(yàn)方法獲得目的片段，送測序驗(yàn)證得到的目的基因是PTENP1。②成功構(gòu)建pcDNA3.1(+)-PTENP1重組質(zhì)粒。③HEK293T細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-PTENP1質(zhì)粒及pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒后，R

7、T-PCR結(jié)果顯示，PTEN基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-PTENP1質(zhì)粒組高于正常組和pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒組(P<0.05)。④轉(zhuǎn)染成功后，Western Blot結(jié)果顯示，PTEN蛋白的含量在pcDNA3.1(+)-PTENP1質(zhì)粒組中高于正常組和pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒組(P<0.05)。⑤轉(zhuǎn)染成功后，Western Blot結(jié)果顯示，PTEN對PI3K/AKT信號通路中重要蛋白分子PI3K、AKT的表達(dá)分