白藜蘆醇通過抑制卵巢癌細(xì)胞糖酵解激活A(yù)MPK-mTOR信號通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的：
　　本課題擬從細(xì)胞水平探索白藜蘆醇對于卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，包括增殖、遷移、侵襲、凋亡，并探索其對于不同卵巢癌細(xì)胞系的IC50藥物濃度，進(jìn)一步揭示白藜蘆醇對于卵巢癌細(xì)胞糖酵解的影響，分別從基因、蛋白水平驗(yàn)證白藜蘆醇的抗腫瘤作用及其可能機(jī)制并從動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒嵌闰?yàn)證了其抗腫瘤效果。
　　方法：
　　1、采用MTT法檢測梯度濃度的白藜蘆醇(25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、800μM)對于

2、人卵巢癌A2780/SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用并計(jì)算白藜蘆醇對于卵巢癌細(xì)胞系的IC50用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，檢測白藜蘆醇對于人正常卵巢上皮細(xì)胞（IOSE-80）和肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)的毒性作用。
　　2、采用細(xì)胞劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測白藜蘆醇對于人卵巢癌A2780和SKOV3細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。
　　3、流式細(xì)胞儀檢測白藜蘆醇作用于A2780和SKOV3細(xì)胞24h、48h及72h后，兩細(xì)胞系的凋亡率變化情況

3、。
　　4、葡萄糖氧化酶法和乳酸氧化酶法檢測白藜蘆醇對于卵巢癌細(xì)胞糖酵解的影響。
　　5、qRT-PCR檢測200μM/100μM白藜蘆醇分別作用于A2780/SKOV3細(xì)胞48h后細(xì)胞中AMPK、mTOR和Caspase3mRNA的表達(dá)水平。
　　6、Western blots檢測白藜蘆醇以及Compound C共培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞A2780/SKOV3細(xì)胞72h后AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR和Clea

4、ved Caspase3、Caspase3蛋白的表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參蛋白。
　　7、SKOV3細(xì)胞建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，分別予以腹腔注射白藜蘆醇溶液(100mg/kg)和溶劑（10％乙醇），對比兩組腫瘤大小、重量及肝腎、腫瘤的HE染色及Ki-67免疫組化染色。
　　結(jié)果：
　　1、梯度濃度的白藜蘆醇對于卵巢癌A2780和SKOV3細(xì)胞皆有抑制增殖作用，并呈濃度依賴關(guān)系，但白藜蘆醇對于正常細(xì)胞抑制作用較弱

5、。
　　2、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白藜蘆醇顯著抑制A2780和SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲。
　　3、流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示白藜蘆醇作用于A2780和SKOV3細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率增加，并呈時間依賴關(guān)系(F=143.557，P＜0.001;F=86.121，P＜0.001)。
　　4、200μM/100μM白藜蘆醇作用于A2780/SKOV3細(xì)胞12h后，上清葡萄糖消耗量減少，乳酸生成量減少（均P＜0.01）;

6、
　　5、200μM/100μM白藜蘆醇分別作用于A2780/SKOV3細(xì)胞48h后，熒光定量PCR顯示AMPK和Caspase3表達(dá)量增加，而mTOR表達(dá)量降低(均P＜0.05)。
　　6、白藜蘆醇作用于A2780/SKOV3細(xì)胞72h后，細(xì)胞中p-AMPK和CleavedCaspase3蛋白條帶灰度增加，而p-mTOR蛋白條帶變細(xì)、灰度降低。而CompoundC(10μM，AMPK特異性抑制劑)與白藜蘆醇共培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞

7、72h后，細(xì)胞活力高于白藜蘆醇單獨(dú)處理組，且細(xì)胞中p-AMPK和Cleaved Caspase3蛋白條帶灰度較白藜蘆醇組降低，而p-mTOR蛋白條帶灰度較白藜蘆醇組灰度增加(均P＜0.05)。
　　7、白藜蘆醇組裸鼠皮下移植瘤生長速度顯著低于對照組(F=36.443，P＜0.001)，皮下移植瘤重量低于對照組(t=2.940，P=0.019)，且Ki-67評分顯著低于對照組(t=6.843;P＜0.001)。
　　8、對照組

8、裸鼠4例出現(xiàn)卵巢癌肝臟轉(zhuǎn)移，而白藜蘆醇治療組僅1例出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移，兩組轉(zhuǎn)移指數(shù)分別為2.2和0.4(P=0.038)。
　　結(jié)論：
　　1、白藜蘆醇呈濃度依賴性抑制人卵巢癌A2780和SKOV3細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，但與A2780相比，SKOV3對于白藜蘆醇更為敏感，提示不同卵巢癌細(xì)胞系對于白藜蘆醇的敏感性具有差異。
　　2、白藜蘆醇抑制人卵巢癌A2780和SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲。
　　3、白藜蘆醇可抑制人卵巢癌