基因調控溶血磷脂酸作用通路抑制卵巢癌細胞生長的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的：卵巢癌由于深居盆底,缺乏早期癥狀體征和有效的診治方法,5年生存率一直徘徊在30％左右,是死亡率最高、危害最大的婦科惡性腫瘤。但是,如果卵巢癌能得到早期診治,Ⅰ期患者5年生存率可達90％以上。因此,研究卵巢癌的早期診斷方法和除手術、化療及放療以外的其它有效新療法是卵巢癌研究的熱點和關鍵。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是具有細胞間信號轉導作用的脂類小分子物質,主要通過G蛋白受體介導的信號轉導

2、通路發(fā)揮多種生物學效應。近年來研究發(fā)現卵巢癌細胞能分泌LPA使患者血漿和腹水中LPA水平明顯升高,90％以上Ⅰ期卵巢癌患者血漿中LPA明顯高于健康人群,Ⅱ-Ⅳ期患者診斷敏感性達100％,其敏感性和特異性均明顯高于目前臨床常用的腫瘤標志物CA125,LPA被認為是一個非常有價值的用于卵巢癌診斷、病情檢測及預后判斷的生物標志物。LPA有3個特異性受體,分別是Edg2、Edg4和Edg7,屬于內皮分化基因家族(endothelial diff

3、erentiation gene family,Edgs)成員。Edg2主要在正常卵巢組織中表達,與卵巢癌關系不大。Edg4和Edg7在卵巢癌細胞中表達水平明顯升高,認為與卵巢癌發(fā)生發(fā)展有關。LPA與受體結合后可活化四條細胞信號轉導通路,促進卵巢癌細胞的增殖、生存、遷移和血管生成,抑制細胞凋亡,與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移等密切相關。LPA的代謝主要通過人磷脂磷酸水解酶-3(human lipid phosphate phospho

4、hydrolase-3,hLPP3)的降解而失活,增強hLPP3基因表達可以降低細胞外LPA水平,降低卵巢癌細胞克隆形成及抑制癌細胞在動物體內的生長。因此,有理由推測通過影響LPA代謝、封閉LPA受體或干擾LPA信號傳導系統(tǒng)及阻斷LPA的一系列級聯反應有可能成為卵巢癌治療的新途徑。LPA及其受體與卵巢癌發(fā)生發(fā)展關系的研究是近年來婦科腫瘤領域的新課題,還有許多未知的問題需要進一步的研究和闡明。比如LPA作為卵巢癌診斷指標尚未被公認和用于臨

5、床,LPA及其受體促使卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機制還不十分清楚,阻斷LPA信號通路是否能抑制卵巢癌細胞生長的研究還沒見報道。
　　本研究擬通過測定LPA及其受體在卵巢癌患者血清和組織中的表達,探討LPA作為卵巢癌早期診斷指標的可行性,驗證LPA及其受體在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用;采用基因導入增強卵巢癌細胞中hLPP3基因表達,通過體內外實驗探討hLPP3對LPA的調節(jié)及對卵巢癌細胞生長的抑制效應;利用RNAi技術沉默LPA受體Edg4和

6、Edg7基因表達,探討阻斷LPA信號轉導通路對卵巢癌細胞生長的抑制作用。本實驗通過不同途徑調控LPA的作用通路,研究LPA及其受體在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展進程中的作用及機制,為卵巢癌基因治療尋找有效的方法和治療靶點。
　　第一部分LPA及其受體在卵巢癌患者血清和組織中的表達及意義
　　材料和方法：1.血清LPA測定
　　1.1.研究對象:研究組:卵巢上皮性性癌患者50例,包括原發(fā)性卵巢癌患者30例(Ⅰ期10例、中晚期即Ⅱ~Ⅳ

7、期20例)和復發(fā)性卵巢癌患者20例,組織學類型為漿液性囊腺癌37例,粘液性囊腺癌13例;良性對照組:良性卵巢上皮性腫瘤20例(漿液性囊腺瘤13例、粘液性囊腺瘤6例、子宮內膜樣腫瘤1例);正常對照組:20例正常婦女。所有病例均經術后病理確診。
　　1.2.研究方法:采用生化法檢測各組患者血清中LPA水平,同時用放射免疫方法測定血清中CA125水平,并將兩者進行比較,探討LPA對卵巢上皮性癌早期診斷的意義。
　　2.卵巢癌組織中

8、Edg4和Edg7蛋白檢測
　　2.1.標本來源:為鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科的存檔臘塊。研究組:上皮性癌組織48例(漿液性囊腺癌30例,粘液性囊腺癌11例,子宮內膜樣癌7例)。臨床分期為Ⅰ期12例,Ⅱ期16例,Ⅲ期18例,Ⅳ期2例;組織學分級為:G1級14例,G2級16例,G3級18例。其中有淋巴結轉移者22例,無淋巴結轉移者26例;腹水≥500ml的30例,腹水<500ml的18例。對照組:交界性上皮性腫瘤10例,良性上皮性腫

9、瘤10例,正常卵巢組織12例。所有研究對象術前均未接受放療或化療,臨床及病理資料完整。
　　2.2.研究方法:采用免疫組化SP法檢測卵巢上皮性腫瘤組織和正常卵巢組織中Edg4和Edg7蛋白的表達情況,并探討這兩種蛋白的表達與卵巢上皮性癌臨床分期、組織學分級、淋巴轉移及腹水量等臨床和病理參數的關系。
　　3.統(tǒng)計學處理計量資料采用單因素方差分析、最小顯著差(LSD)檢驗;分類資料采用x2檢驗和Kruskal-Wallis法秩和

10、檢驗;相關性分析采用Spearman等級相關分析,以α=0.05為檢驗水準,在SPSS13.0上完成。
　　結果：1.各期卵巢上皮性癌患者血清LPA水平均明顯升高,與正常婦女和良性卵巢上皮性腫瘤患者相比,其差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001);Ⅰ期卵巢上皮性癌患者血清LPA水平也明顯升高,與正常婦女和良性卵巢上皮性腫瘤患者相比差異有顯著性(P<0.001),其水平接近中晚期患者(P>0.05);良性卵巢上皮性腫瘤患者血清中LPA表

11、達水平較正常婦女略高,但差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。原發(fā)性卵巢癌Ⅱ~Ⅳ期組和復發(fā)組患者血清CA125水平明顯高于正常婦女組和良性卵巢上皮性腫瘤組,其差別有統(tǒng)計學意義(P<0.001);Ⅰ期卵巢上皮性癌患者血清CA125水平輕度升高,與良性卵巢上皮性腫瘤患者和正常婦女相比無明顯差異(P>0.05)。
　　2.血清LPA水平升高用于檢測卵巢上皮性癌的敏感性為96％、特異性為90％、假陽性率10％、假陰性率4％,陽性預測值96％、

12、陰性預測值90％,血清CA125分別為72％、80％、20％、28％、90％、53.3％,與CA125相比LPA有較高的敏感性、較低的假陰性率及較高的陰性預測值(P<0.05)。LPA用于檢測Ⅰ期卵巢上皮性癌的敏感性為90％、特異性90％、假陽性率10％、假陰性率10％、陽性預測值81.8％,陰性預測值94.7％,而CA125分別為30％、80％、20％、70％、42.9％和69.6％,LPA對Ⅰ期上皮性卵巢癌檢測的敏感性、陽性預測值及

13、陰性預測值高于CA125,假陰性率低于CA125(P<0.05)。LPA檢測原發(fā)性卵巢上皮性癌Ⅰ期、Ⅱ~Ⅳ期、復發(fā)性卵巢癌患者的約登指數分別為:0.8、0.85和0.9,而CA125檢測的約登指數分別為:0.1、0.6和0.65,提示LPA是檢測早期上皮性卵巢癌的良好指標。
　　3.溶血磷脂酸受體Edg4、Edg7蛋白在卵巢上皮性腫瘤組織中的陽性表達率分別為惡性91.7％和95.8％、交界性80％和70％、良性20％和30％,而在

14、正常卵巢組織中陽性表達率僅為16.7％和16.7％,提示Edg4、Edg7在正常卵巢組織中呈低表達狀態(tài);在良性卵巢上皮性腫瘤組織中的表達較正常組織中稍高,但其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而在交界性卵巢上皮性腫瘤和卵巢上皮性癌組織中Edg4、Edg7的表達均顯著高于正常卵巢組織及良性上皮性腫瘤組織(P<0.001),多數上皮癌組織中著色呈“+++”,提示兩種受體蛋白在卵巢上皮性癌組織中呈高表達狀態(tài)。
　　4.卵巢上皮性癌組織中

15、Edg4和Edg7蛋白在Ⅲ、Ⅳ期的陽性表達明顯高于Ⅰ、Ⅱ期;G2、G3級組織中兩種蛋白的表達明顯高于G1級組織;有淋巴結轉移的癌組織中兩種蛋白的表達明顯高于無淋巴結轉移的癌組織;腹水>500ml的癌組織中兩種蛋白的表達明顯高于腹水<500ml的癌組織,比較結果差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示在卵巢上皮性癌組織中,Edg4和Edg7的高表達與癌組織學分級、臨床分期、淋巴結轉移及腹水量增加有關。
　　5.Edg7蛋白在卵巢上皮

16、性癌組織中的表達陽性率略高于Edg4蛋白,但無統(tǒng)計學差異(P>0.05);Edg4和Edg7蛋白的表達狀態(tài)趨勢一致,經相關性分析兩者的表達呈正相關(P<0.05)。
　　小結：1.卵巢上皮性癌患者血清中LPA水平明顯升高,其敏感性高于血清CA125,假陰性率低于CA125,尤其是在早期卵巢癌患者更明顯。提示LPA有望成為卵巢癌早期診斷新的敏感標記物。
　　2.溶血磷脂酸受體蛋白Edg4與Edg7在卵巢上皮性癌組織中的表達水平

17、明顯升高,并與上皮性癌的臨床分期、組織學分級、淋巴轉移和腹水量呈正相關。提示Edg4和Edg7可能在卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉移中具有重要作用。
　　3.Edg4和Edg7受體蛋白在卵巢上皮性癌組織中表達程度呈正相關,推測二者在卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展中具有協同作用。
　　4.LPA及其受體Edg4和Edg7在卵巢癌患者血清及組織中的高表達等上述結果為下一步的研究即基因調控LPA作用通路抑制卵巢癌細胞生長的研究提供了理論

18、和實驗依據。
　　第二部分增強人磷脂磷酸水解酶-3基因表達對卵巢癌細胞生長的抑制作用
　　材料和方法：1.從胎盤組織中逆轉錄擴增目的基因以人胎盤組織總RNA為模板,根據GenBank上的hLPP3基因cDNA編碼序列(BC009196)設計引物:上游引物LPP3-1 5’TGGATCCTCCACCATGCAAAACT ACAAGTACGAC 3’(372-392);下游引物LPP3-2 5’CCTCGAGCTACATCAT

19、GTTGTGGTGAT 3’(1288-1307)。采用RT-PCR技術擴增合成的雙鏈DNA,凝膠電泳回收鑒定。
　　2.將目的基因克隆入克隆及表達質粒載體將目的基因hLPP3克隆入pGEM-T easy質粒載體,利用α互補和T7/SP6 PCR擴增篩選鑒定重組子pGEM-T-hLPP3;用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組子pGEM-T-hLPP3和真核表達載體pLenExpress質粒;將雙粘的hLPP3片段亞克隆入表達載體pLe

20、nExpress中;利用PCR擴增及BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切篩選鑒定重組子pLenExpress-hLPP3;對插入序列進行DNA序列分析。
　　3.包裝產生表達目的基因的慢病毒將表達hLPP3基因的表達載體及輔助包裝載體應用脂質體協助轉染293FT細胞包裝病毒,產生帶有綠色熒光蛋白(GFP)并表達hLPP3基因的慢病毒顆粒(lentivires),測定病毒滴度。
　　4.表達目的基因慢病毒體外細胞轉染實驗用表達hLPP3

21、的慢病毒轉染卵巢癌細胞系SKOV3和OVCAR3細胞(實驗組),用空載體包裝的慢病毒轉染細胞及未轉染細胞作為對照組。利用熒光顯微鏡觀察轉染陽性率,加入G418篩選穩(wěn)定表達hLPP3的細胞株;生化法測定轉染前后細胞培養(yǎng)上清液中LPA含量變化;采用實時熒光定量PCR測定各組細胞中hLPP3mRNA表達水平;流式細胞儀檢測各組卵巢癌細胞的細胞周期和凋亡率改變。
　　5.裸鼠體內移植瘤實驗用SKOV3和OVCAR3細胞及穩(wěn)定表達hLPP3

22、基因的SKOV3和OVCAR3細胞接種裸鼠,構建卵巢癌裸鼠移植瘤動物模型,觀察移植瘤生長情況,并測量移植瘤大小;將移植瘤作病理切片檢查,實時熒光定量PCR測定移植瘤組織中hLPP3mRNA表達,流式細胞儀檢測腫瘤細胞周期變化和細胞的凋亡率。
　　結果：1.成功擴增出目的基因利用RT-PCR從胎盤組織中擴增出目的基因hLPP3,電泳條帶約在936bp。
　　2.成功構建表達目的基因的重組真核表達載體PCR產物與pGEM-Tea

23、sy載體連接后,轉化JM109大腸桿菌,篩選鑒定得到正確重組子pGEM-T-hLPP3。進行亞克隆后,用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切對重組質粒進行鑒定,得到pLenExpress-hLPP3重組真核表達載體。對重組子pLenExpress-hLPP3插入片段DNA序列測序,結果與設計完全一致。
　　3.獲得高濃度的表達目的基因的慢病毒并對卵巢癌細胞系具有高轉染效率。 用重組表達載體和包裝載體包裝慢病毒,其滴度分別如下:表達hLPP3

24、基因的慢病毒:3.1×10~4 IU/ml;空載體包裝的慢病毒:2.7×10~7 IU/ml。表達hLPP3的慢病毒轉染卵巢癌SKOV3細胞陽性率為92％,高于轉染OVCAR3細胞的陽性率(76％)。
　　4.實驗組細胞中hLPP3mRNA表達水平明顯增加 表達hLPP3的慢病毒轉染卵巢癌細胞系后,經實時熒光定量PCR檢測實驗組卵巢癌細胞的hLPP3 mRNA相對表達量比空載體組及無轉染對照組明顯增加(P＜0.05);而無轉染對照

25、組與空載體組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。SKOV3與OVCAR3之間hLPP3 mRNA相對表達量比較無統(tǒng)計差異(P＞0.05)。
　　5.實驗組卵巢癌細胞培養(yǎng)上清液中LPA含量明顯降低 慢病毒轉染細胞后不同時間測定上清液中LPA水平,結果顯示實驗組LPA水平較對照組明顯下降,且隨著轉染時間延長,LPA含量有進一步下降趨勢(P＜0.05),存在時間-效應關系。兩種卵巢癌細胞系SKOV3和OVCAR3之間LPA水平比較無統(tǒng)計學

26、差異(P＞0.05)。
　　6.實驗組細胞凋亡率明顯增加 實驗組卵巢癌細胞凋亡率明顯增加,由轉染前0.1±0.034％到轉染后增加為30.50±2.12％,兩者比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實驗組細胞凋亡率明顯高于兩個對照組(P＜0.05)。實驗組卵巢癌細胞周期改變不明顯(P＞0.05)。
　　7.成功構建卵巢癌及轉基因卵巢癌裸鼠移植瘤模型 用卵巢癌細胞系及表達目的基因的卵巢癌細胞株皮下注射局部生長成瘤,實驗組移植瘤體積

27、及重量均小于空載體組和無轉染對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。SKOV3細胞形成的移植瘤生長情況與OVCAR3細胞的相似,兩者比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　8.體內移植瘤實驗結果 實驗組裸鼠移植瘤組織中hLPP3 mRNA的相對表達量明顯高于空載體組和無轉染對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而對照組與空載體組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。SKOV3與OVCAR3之間hLPP3 mRNA相對表達量比較無

28、統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。實驗組裸鼠移植瘤細胞的凋亡率為16.5％,而空載體組細胞凋亡率為1.26％,無轉染對照組細胞凋亡率則為0.10％,實驗組細胞的凋亡率明顯高于兩個對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。各組細胞周期無明顯變化(P＞0.05)。
　　小結：1.成功構建并產生出表達hLPP3的真核表達載體及慢病毒顆粒,并對卵巢癌細胞系SKOV3和OVCAR3細胞轉染效率高且容易鑒定,獲得了穩(wěn)定表達hLPP3基因的卵巢癌細胞

29、株。
　　2.體外實驗,表達hLPP3的慢病毒轉染卵巢癌細胞后,細胞內hLPP3 mRNA水平明顯升高,細胞上清液的LPA水平明顯降低,細胞凋亡率明顯增加。提示增強hLPP3基因表達能有效降低LPA水平,促進細胞凋亡,其機制可能通過水解胞外的LPA或/和減少細胞LPA釋放,抑制LPA的促腫瘤效應。
　　3.成功建立了卵巢癌裸鼠移植瘤模型及穩(wěn)定高表達hLPP3基因的卵巢癌裸鼠移植瘤模型,后者體內移植瘤細胞生長速度明顯減慢,hL

30、PP3 mRNA水平和細胞凋亡率增加。提示增強hLPP3基因表達在體內也能有效抑制卵巢癌細胞生長,促進細胞凋亡,其機制可能與體外一樣通過降低LPA水平發(fā)揮抑瘤效應。
　　4.體內外實驗均證明增強hLPP3基因表達能抑制卵巢癌細胞生長,促進腫瘤細胞凋亡,提示調控hLPP3基因可能成為卵巢癌基因治療的新靶點。
　　第三部分RNA干擾沉默溶血磷脂磷酸受體Edg4和Edg7基因表達對卵巢癌生長的抑制效應
　　材料和方法：1.設

31、計合成Edg4和Edg7siRNA序列及發(fā)夾樣DNA寡核苷酸單鏈 依據GenBank中Edg4基因(NM_004720)和Edg7基因(NM_012152)的序列,遵循siRNA設計原則進行設計及篩選,選擇確定19個堿基的siRNA靶序列。各設計2對包含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點的靶向Edg4和Edg7發(fā)夾樣DNA寡核苷酸,并合成2對編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈。設計合成無關序列DNA鏈作為對照。
　　2.構建目的基因的克隆

32、載體和真核表達載體 將發(fā)夾樣DNA序列退火成雙鏈DNA,克隆入pGEM-T Easy載體,利用α互補和T7/SP6引物經PCR擴增篩選鑒定重組子pGEM-T-siEdg4和pGEM-T-siEdg7;用BamHⅠ和XhoⅠ限制性內切酶雙酶切重組子和siRNA真核表達載體pRNAT-U6.1/lenti;將雙粘發(fā)夾樣siRNA片段亞克隆入pRNAT-U6.1/lenti中;利用通用引物PCR篩選及雙酶切鑒定重組子;對插入序列進行DNA序列

33、分析。
　　3.包裝產生表達目的基因的慢病毒 將測序正確的siRNA表達載體和輔助包裝載體應用脂質體包裹轉染293FT細胞包裝病毒,產生表達不同siRNA序列的慢病毒顆粒,并測定病毒滴度。
　　4.體外細胞轉染實驗 用表達不同目的基因的慢病毒轉染入卵巢癌細胞系SKOV3細胞,用G418篩選穩(wěn)定表達siRNA的細胞株。體外實驗分為三個對照組和四個實驗組,分別為未轉染對照組C1,轉染空載體包裝的病毒對照組(C2),轉染無關序列s

34、iRNA包裝的病毒對照組(C3),轉染siEdg4病毒組(T1),轉染siEdg7病毒組(T2),共轉染siEdg4病毒和siEdg7病毒組(T3),以及共轉染siEdg7病毒和表達hLPP3的病毒組(T4)。利用熒光顯微鏡觀察SKOV3細胞中的轉染率;用生化法測定細胞培養(yǎng)上清液中LPA含量變化;用實時熒光定量PCR方法檢測細胞Edg4和Edg7mRNA表達水平;用Western Blot測定Edg4和Edg7蛋白表達情況;用流式細胞儀

35、檢測轉染細胞的細胞周期和凋亡率變化。
　　5.裸鼠體內移植瘤實驗 用SKOV3細胞及穩(wěn)定表達不同siRNA的SKOV3細胞接種裸鼠,構建表達不同基因的卵巢癌裸鼠移植瘤模型,在體內研究沉默Edg4和Edg7基因表達對卵巢癌細胞生長的影響及其作用機制。測量移植瘤大小和重量,比較各組移植瘤生長情況;實時熒光定量PCR測定瘤細胞中兩種受體mRNA表達情況;免疫組化SP法檢測移植瘤中Edg4和Edg7蛋白表達情況;流式細胞儀測定移植瘤細胞周

36、期及細胞凋亡率變化。
　　結果：1.Edg4和Edg7siRNA靶序列篩選及發(fā)夾DNA單鏈設計合成 對候選序列通過同源序列檢索和進一步優(yōu)選,最后確定212-230位(GACCATCGGCTTCTTCTAT)和323-341位(GACCAATCTGCTGGTCATA)為Edg4-siRNA靶序列;277-295位(GCTGGAATTGCCTATGTAT)和697-715位(GTCTTGTCTCCGCATACAA)為Edg7-siRN

37、A靶序列;(TACGCTGACTTGATTGTTC)為無關對照序列。 Edg4發(fā)夾樣siRNA寡核苷酸序列 Position in gene sequence:212-230 BamHI Target sequence:sense Hairpin Target sequence:antisense XhoIAl 11 5'-GGATCC GACCATCGGCTTCTTCTAT TTCAAGAGA ATAGAAGAAGCCGATGGTC

38、TTTTTT CTCGAGA -3'Al 12 3'-ACCTAGG CTGGTAGCCGAAGAAGATA AAGTTCTCT TATCTTCTTCGGCTACCAG AAAAAA GAGCRC-5' BamHI Target sequence:sense Hairpin Target sequence:antisense XhoIAl 21 5'-GGATCC GACCAATCTGCTGGTCATA TTCAAGAGA TATGAC

39、CAGCAGATTGGTC TTTTTT CTCGAGA -3'Al 22 3'- ACCTAGG CTGGTTAGACGACCAGTAT AAGTTCTTCT ATACTGGTCGTCTAACCAG AAAAAA GAGCTC -5' Position in gene sequence:323-341 Edg7發(fā)夾樣siRNA寡核苷酸序列 Position in gene sequence:697-715 BamHI Target s

40、equence:sense Hairpin Target sequence:antisense XhoIA211 5'-GGATCC GTCTTGTCTCCGCATACAA TTCAAGAGA TTGTATGCGGAGACAAGAC TTTTTT CTCGAGA-3'A212 3'-ACCTAGGCAGAACAGAGGCGTATGTT AAGTTCTCT AACATACGCCTCTGTTCTG AAAAAA GAGCTC-5' BamH

41、I Target sequence:sense Hairpin Target sequence:antisense XhoIA221 5'-GGATCC GCTGGAATTGCCTATGTAT TTCAAGAGA ATACATAGGCAATTCCAGC TTTTTT CTCGAGA-3'A222 3'-ACCTAGGCGACCTTAACGGATACATA AAGTTCTCT TATGTATCCGTTAAGGTCG AAAAAA GAGC

42、TC -5' Position in gene sequence:277-295 無關序列對照發(fā)夾樣siRNA寡核苷酸序列 BamHI位點Target sequence:sense Hairpin Target sequence:antisense XhoI位點C1 5'- GGATCC TACGCTGACTTGATTGTTC TTCAAGAGA GAACAATCAAGTCAGCGTA TTTTTT CTCGAGA-3'C2 3'-AC

43、CTAGG ATGCGACTGAACTCAAG AAGTTCICT CTTGTTAGTTCAGTCGCAT AAAAAA GAGCTC-5'
　　2.成功克隆表達目的siRNA的克隆載體和真核表達載體 不同序列的發(fā)夾DNA退火產物與pGEM-T Easy連接后,轉化JM109,篩選鑒定后得到重組子pGEM-T-siEdg4、pGEM-T-siEdg7和pGEM-T-siC。亞克隆入表達質粒pRNAT-U6.1/lenti后,用通用

44、引物對重組表達質粒進行鑒定,得到真核表達載體pRNAT-U6.1/lenti-siEdg4、pRNAT-U6.1/lenti-siEdg7和pRNAT-U6.1/lenti-siC。對重組子進行測序,結果與設計完全一致。
　　3.表達不同目的基因慢病毒滴度 采用脂質體Lipofectaminc~(TM) 2000包裹構建的siRNA表達載體及包裝載體,轉染293FT細胞,產生表達不同siRNA的慢病毒顆粒(Lentivirus),

45、測定其滴度如下:針對Edg4基因的siRNA Lentivirus—siEdg4/lenti病毒3.2×10~7 IU/ml;針對Edg7基因的siRNA Lentivirus—siEdg7/lenti病毒4.1×10~7 IU/ml;無關對照的siRNA Lentivirus—siC/lenti病毒4.3×10~7 IU/ml;空載體包裝的Lentivirus—pRNAT-U6.1/Lenti病毒2.7×10~7 IU/ml。

46、　　4.重組慢病毒能高效轉染卵巢癌細胞系 含有不同siRNA的病毒轉染卵巢癌SKOV3細胞,培養(yǎng)48h后采用熒光顯微鏡觀察,結果顯示除了未轉染組細胞,其余各組SKOV3細胞的胞核和胞漿內均有大量綠色熒光信號,細胞轉染陽性率均在90％以上(92％～95％),說明重組慢病毒可以高效轉染卵巢癌SKOV3細胞,而且目的siRNA的插入不影響慢病毒對細胞的轉染力。
　　5.慢病毒體外細胞轉染結果
　　5.1.實時熒光定量PCR方法分別

47、測定各組細胞中Edg4和Edg7 mRNA的表達水平,結果顯示:轉染siEdg4和siEdg7慢病毒的T1組和T2組卵巢癌SKOV3細胞中Edg4和Edg7的mRNA表達水平明顯降低,與對照組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而3個對照組卵巢癌細胞中Edg4和Edg7 mRNA表達均較高,相互之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。2個共轉染實驗組mRNA表達更低,與其它單獨轉染組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

48、　　5.2.Western Blot檢測結果顯示3個對照組細胞中Edg4和Edg7兩種蛋白表達水平較高,分子量約40KD,而實驗組中相應Edg4和Edg7蛋白表達水平明顯降低。提示siRNA良好的靶向性。
　　5.3.各實驗組轉染后細胞上清液中LPA含量明顯下降,且隨著轉染時間的延長,細胞上清液中的LPA含量降低更明顯(P＜0.05)。而3個對照組轉染前后LPA含量變化不明顯(P＞0.05),實驗組與對照組相比較,差異有統(tǒng)計學意義

49、(P＜0.05)。
　　5.4.轉染siRNA慢病毒對卵巢癌細胞SKOV3細胞周期影響主要表現為實驗組的細胞S期比例降低,G_2期比例升高,差異有顯著性(P＜0.05),而3個對照組的細胞周期無明顯變化(P＞0.05)。轉染后實驗組細胞凋亡率明顯增加,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);其中兩個共轉染實驗組較單獨轉染實驗組細胞凋亡率更高,3個對照組細胞凋亡率無明顯變化(P＞0.05)。
　　6.裸鼠體內移植瘤實驗結

50、果
　　6.1.實驗組裸鼠移植瘤生長緩慢:各組卵巢癌細胞接種入裸鼠皮下后生長成瘤。各實驗組移植瘤體積小于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),兩個共轉染組移植瘤體積明顯小于單轉染組(P＜0.05),但兩個共轉染組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。處死裸鼠后的移植瘤重量實驗組明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　6.2.對裸鼠皮下移植瘤組織進行Edg4和Edg7蛋白的免疫組化SP法染色,陽性表達主

51、要表現為胞膜和胞漿著色,實驗1、3組Edg4蛋白表達水平明顯降低,實驗2、3、4組Edg7蛋白表達明顯降低,與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。而對照組之間比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　6.3.實驗組移植瘤組織中兩種受體mRNA的相對表達量明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),而對照組之間比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　6.4.實驗組裸鼠移植瘤細胞的凋亡率分別為(16.75±1.24)％、

52、(15.80±1.35)％、(25.42±3.24)％和(24.63±2.76)％,3個對照組細胞凋亡率分別為(1.68±0.03)％、(1.76±0.04)％和(0.67±0.002),各實驗組細胞的凋亡率明顯高于3個對照組細胞,比較結果有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　小結：1.成功設計并構建了真對Edg4和Edg7的真核表達載體pRNAT-U6.1/lenti-siEdg4和pRNA-U6.1/lenti-siEdg7,并

53、包裝生產出表達Edg4和Edg7siRNA序列的慢病毒顆粒,兩種病毒均能高效轉染卵巢癌細胞系SKOV3細胞并持久表達,獲得了穩(wěn)定表達siEdg4和siEdg7的SKOV3細胞株。
　　2.體外實驗表明,RNAi沉默Edg4或Edg7基因表達能靶向抑制卵巢癌細胞內相應的Edg4或Edg7 mRNA及蛋白表達,降低細胞培養(yǎng)上清液中LPA水平,阻滯細胞周期進程,增加癌細胞的凋亡率,同時沉默兩個受體作用更明顯。提示封閉Edg4或/和Edg

54、7基因表達均能有效抑制LPA的促腫瘤作用,Edg4和Edg7在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中具有協同作用。
　　3.沉默Edg7基因表達和增強hLPP3基因表達能更明顯的降低細胞外LPA水平,增加腫瘤細胞凋亡,hLPP3對Edg7mRNA表達及細胞周期無明顯影響。提示封閉Edg7和增強hLPP3基因表達對降低細胞外LPA水平和促進腫瘤細胞凋亡有協同作用,hLPP3主要通過降低LPA水平發(fā)揮作用。
　　4.成功構建了穩(wěn)定表達siEdg4和

55、siEdg7的卵巢癌裸鼠移植瘤模型,體內實驗表明封閉Edg4或/和Edg7及增強hLPP3基因在體內也能明顯抑制兩種受體的mRNA和蛋白表達,促進細胞凋亡,抑制腫瘤細胞生長,發(fā)揮和體外相似的抑制腫瘤效應。
　　5.沉默Edg4或/和Edg7基因表達及增強hLPP3基因表達在體內外均能有效抑制卵巢癌細胞系SKOV3細胞中LPA的促腫瘤作用,提示對LPA受體及hLPP3基因的調控可能成為卵巢癌的基因治療的有效靶點和新方法。該研究為驗證

56、LPA及其受體與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的關系提供了實驗和理論依據,也為利用RNAi技術進行卵巢癌基因治療研究奠定了基礎并提供了新思路。
　　全文結論：1.卵巢上皮性癌息者血清中LPA水平明顯升高,其敏感性高于血清CA125,尤其是在早期卵巢癌患者更明顯。提示LPA有望成為新的敏感的卵巢上皮性癌早期診斷的生物學標記物。
　　2.溶血磷脂酸受體蛋白Edg4與Edg7在卵巢上皮性癌組織中的表達明顯升高,并與上皮性癌的臨床分期、組織學分級

57、、淋巴結轉移和腹水量呈正相關。提示LPA及其受體Edg4和Edg7可能在卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉移中具有重要作用。
　　3.成功包裝出表達hLPP3的慢病毒對卵巢癌細胞系SKOV3和OVCAR3細胞轉染效率高,轉染后在體內外均能增強hLPP3基因表達,有效降低LPA水平,促進細胞凋亡,抑制卵巢癌細胞生長。其機制可能通過水解胞外的LPA或/和減少細胞LPA釋放,抑制LPA的促腫瘤效應。
　　4.成功設計并構建了表達Ed

58、g4和Edg7siRNA的慢病毒,能高效轉染卵巢癌細胞系SKOV3細胞并持久表達。體內外實驗表明,RNA干擾沉默Edg4或Edg7基因表達均能明顯抑制癌細胞內相應的Edg4和Edg7 mRNA及蛋白表達,降低細胞培養(yǎng)上清液中LPA水平,阻滯細胞周期進程,增加癌細胞的凋亡率,抑制細胞生長,同時沉默Edg4和Edg7具有協同作用。
　　5.同時沉默Edg7基因表達及增強hLPP3基因表達在體內外均能有效抑制卵巢癌細胞系SKOV3細胞中

59、LPA的促腫瘤作用,二者具有協同作用。
　　6.該研究為驗證LPA及其受體與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的關系提供了實驗和理論依據,也為利用RNAi技術進行卵巢癌基因治療研究奠定了基礎并提供了新思路。對LPA受體Edg4、Edg7及hLPP3基因的調控可能成為卵巢癌的基因治療的有效靶點和新方法。
　　7.有關表達hLPP3基因慢病毒的構建和體內外轉染實驗、利用RNA干擾技術沉默LPA受體Edg4、Edg7抑制卵巢癌細胞生長實驗以及同時沉