棉酚通過氧化應(yīng)激引起卵巢癌細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的:本文運(yùn)用代謝組學(xué)和氧化還原組學(xué)的方法研究棉酚對卵巢癌細(xì)胞SKOV3的作用，以理解棉酚誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.流式細(xì)胞分析:SKOV3細(xì)胞被均勻分入六孔板中，用不同濃度的棉酚處理24小時(shí)。然后按照收細(xì)胞，固定，加核糖核酸酶，碘化丙啶染色，流式分析的步驟進(jìn)行，數(shù)據(jù)通過CELL Quest軟件分析獲得。
　　 2.ROS檢測:實(shí)驗(yàn)組和對照組的SKOV3細(xì)胞使用10μM的棉酚處理24小時(shí)

2、，離心收集，并使用溫的HBSS/Ca/Mg溶液潤洗一次。細(xì)胞用500μL25μM的carboxy-H2DCFDA工作液重懸，37℃孵育25分鐘，然后將Hoechst33342試劑加入反應(yīng)體系，其終濃度為1.0μM，孵育5分鐘。終產(chǎn)物用1ml HBSS/Ca/Mg輕柔的潤洗，然后立即使用Zeiss710共聚焦顯微鏡拍照。
　　 3.代謝組學(xué)分析:運(yùn)用-80℃預(yù)冷的甲醇萃取，然后反復(fù)凍融的方法提取SKOV3細(xì)胞代謝產(chǎn)物。為了定量實(shí)驗(yàn)

3、組和對照組中含氨基的分子，采取了直接濃縮和TMT標(biāo)記兩種方式，并分別使用液相質(zhì)譜分析。LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀通過X-calibur2.0.7軟件生成數(shù)據(jù)，通過分析每張質(zhì)譜圖來尋找標(biāo)記的氨基酸及相關(guān)碎片，分析細(xì)胞的代謝產(chǎn)物水平的變化。
　　 4.巰基的區(qū)分性捕捉:SKOV3細(xì)胞使用1％的NP-40裂解液裂解，蛋白濃度通過標(biāo)準(zhǔn)的BCA法測得。在樣品中加入非變性的蛋白上樣緩沖液，跑非還原SDS-PAGE。棉酚處理和未處理組均按

4、照巰基雙標(biāo)記法進(jìn)行操作，即先用13C-碘乙酸標(biāo)記游離的巰基，DTT還原后，再用12C-IAM標(biāo)記結(jié)合狀態(tài)的巰基，然后質(zhì)譜級胰酶消化過夜，最后用50％乙腈、1％三氟乙酸萃取兩次，濃縮、裝樣、送檢。
　　 將LC-MS/MS檢測得到的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過Mascot核心算法或者人類蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)檢索算法來檢索。搜索條件如下:胰蛋白酶特異性全酶解，允許2個(gè)酶切錯(cuò)誤，將脲甲基(57.021Da)和13C-羧甲基化(60.005Da)設(shè)置為半胱氨

5、酸可變修飾，氧化(M)同樣被設(shè)置為可變修飾，離子阱色譜儀中所獲得的所有一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)的質(zhì)量誤差為10 ppm，二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)中碎片離子的質(zhì)量誤差為0.5Da。搜索錯(cuò)誤和虛假的發(fā)現(xiàn)率(FDR)被設(shè)置為1％。
　　 結(jié)果:
　　 1.流式凋亡結(jié)果:棉酚處理的SKOV3細(xì)胞比未用棉酚處理的SKOV3細(xì)胞在M1區(qū)域的細(xì)胞群體增多，同時(shí)健康細(xì)胞數(shù)量減少。通過DNA染色，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率隨棉酚濃度的增加而升高。據(jù)估計(jì)，在50μM棉酚處理細(xì)

6、胞24小時(shí)后細(xì)胞的凋亡率達(dá)到70％。
　　 2.ROS檢測結(jié)果:三次重復(fù)試驗(yàn)均表明:棉酚處理過的細(xì)胞相比于未經(jīng)處理的細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的綠色熒光，表明棉酚處理增加了在細(xì)胞中ROS的顯示，而未經(jīng)處理的細(xì)胞表現(xiàn)出最小的熒光。
　　 3.代謝組學(xué)分析結(jié)果:通過使用準(zhǔn)確的測量質(zhì)量，確定了約50代謝產(chǎn)物。使用TMT標(biāo)簽的定量檢測，發(fā)現(xiàn)那些來自未處理細(xì)胞的樣品中谷胱甘肽(GSH)，谷氨酰胺，天冬氨酸和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)這三種代

7、謝物的濃度比未處理過的細(xì)胞低。
　　 4.氧化還原狀態(tài)結(jié)果:通過正反庫檢索，并人工比對后確定了約2000種蛋白，假陽性率估計(jì)小于1％。確認(rèn)了棉酚引起356個(gè)蛋白質(zhì)上545個(gè)含有半胱氨酸的肽段的巰基發(fā)生了氧化還原狀態(tài)的變化。這些蛋白參與了一系列諸如細(xì)胞代謝，氧化應(yīng)激，凋亡以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的細(xì)胞進(jìn)程。使用非定量標(biāo)記分析，比較了在棉酚未處理和處理后的樣品中13C-羧甲基化的肽段的強(qiáng)度，215個(gè)肽段的水平增加，而330個(gè)肽段減少。