胰島素對ER-α甲基化調(diào)控在動脈粥樣硬化中的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行論述：
　　第一部 胰島素對雌激素受體α甲基化調(diào)控在血管平滑肌細胞增殖中的作用研究
　　目的：
　　研究ER-α甲基化在胰島素促進血管平滑肌細胞的增殖及動脈粥樣硬化中的作用。
　　方法：
　　1.觀察胰島素對ApoE/Lepr雙基因敲除小鼠主動脈動脈粥樣硬化斑塊形成的影響及對主動脈VSMCs細胞核ER-α表達的作用。對8周齡的ApoE/Lepr雙基因敲除小鼠分別腹腔內(nèi)注射胰島素或生理

2、鹽水，每周檢測小鼠的體重和空腹血糖，連續(xù)12周后對小鼠主動脈石蠟切片進行HE染色和ER-α免疫組化實驗。
　　2.觀察胰島素對大鼠血管平滑肌細胞ER-α、DNMT1、DNMT3a表達的作用。胰島素干預大鼠血管平滑肌細胞后，分別用Western blot和qPCR方法檢測大鼠VSMCsER-α、DNMT1、DNMT3a蛋白及mRNA的表達。
　　3.觀察甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza對胰島素抑制大鼠血管平滑肌細胞ER-α表達的作用

3、。分別用5-Aza或5-Aza與胰島素共同干預大鼠VSMCs，用Western blot和qPCR方法檢測大鼠VSMCs ER-α蛋白及mRNA的表達。
　　4.觀察胰島素對大鼠VSMCs ER-α甲基化的作用。分別用胰島素或5-Aza與胰島素共同干預大鼠VSMCs，用BSP方法檢測VSMCs ER-α甲基化水平。
　　5.觀察上調(diào)大鼠VSMCs ER-α的表達對VSMCs增殖和遷移能力的影響。構(gòu)建ER-α高表達慢病毒載體，

4、并感染大鼠VSMCs，用流式細胞術(shù)檢測ER-α高表達VSMCs的細胞周期，用CCK-8和EdU檢測細胞的增殖情況，劃痕實驗檢測細胞的遷移情況。
　　6.觀察大鼠VSMCs ER-α第二外顯子調(diào)控序列甲基化水平對基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。首先，構(gòu)建ER-α第二外顯子調(diào)控序列pGL3-promoter熒光素報告載體;其次，大鼠ER-α第二外顯子調(diào)控序列進行體外人工甲基化，并用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶(AciⅠ)酶切鑒定;最后，甲基化和模擬甲

5、基化ER-α第二外顯子調(diào)控序列pGL3-promoter熒光素報告載體分別轉(zhuǎn)染293FT細胞，并用雙熒光素酶報告基因檢測基因轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)果：
　　1.ApoE/Lepr雙基因敲除小鼠腹腔內(nèi)注射胰島素或生理鹽水12周后，兩組小鼠的體重、血糖無明顯差異，胰島素組小鼠的胰島素水平及HOMA-IR顯著高于對照組。
　　2.ApoE/Lepr雙基因敲除小鼠主動脈石蠟切片HE染色結(jié)果顯示，胰島素組小鼠的主動脈壁顯著增厚，并出

6、現(xiàn)顯著的動脈粥樣硬化斑塊，血管腔變窄，中層平滑肌細胞增多，細胞核排列紊亂。而對照組小鼠主動脈內(nèi)膜光滑，管腔無狹窄，血管壁無增厚，中層平滑肌細胞核排列整齊。ER-α免疫組化結(jié)果顯示，胰島素組小鼠主動脈平滑肌細胞核上的ER-α表達顯著低于對照組小鼠。
　　3.胰島素干預大鼠VSMCs后ER-α蛋白和mRNA的表達均顯著降低，并隨干預時間的延長而進一步降低;而DNMT1、DNMT3a蛋白及mRNA的表達則顯著增加，并且隨干預時間的延長而

7、增加。
　　4.5-Aza與胰島素共同干預大鼠VSMCs后ER-α蛋白的表達較對照組顯著增加，mRNA的表達與對照組無明顯差異。
　　5.胰島素干預大鼠VSMCs后ER-α第二外顯子甲基化水平增加，而5-Aza與胰島素共同干預后ER-α第二外顯子甲基化水平較對照組和胰島素組均顯著降低。
　　6.用ER-α高表達慢病毒感染大鼠VSMCs，上調(diào)ER-α的表達后，流式細胞術(shù)及CCK-8、EdU結(jié)果均顯示VSMCs的增殖受到抑

8、制，劃痕實驗結(jié)果顯示VSMCs的遷移能力同樣也受到抑制。
　　7.大鼠VSMCs ER-α第二外顯子調(diào)控序列能夠增強基因轉(zhuǎn)錄活性，而在大鼠VSMCs ER-α第二外顯子調(diào)控序列甲基化后基因轉(zhuǎn)錄活性受到抑制。
　　結(jié)論：
　　胰島素能夠促進ApoE/Lepr雙基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，并降低主動脈平滑肌細胞ER-α的表達。其機制是胰島素是通過誘導VSMCs ER-α第二外顯子甲基化降低ER-α的表達，從而促進

9、VSMCs的增殖和遷移及動脈粥樣硬化的形成。本研究闡明了胰島素促進VSMCs增殖和致動脈粥樣硬化的新機制，為動脈粥樣硬化性疾病的治療提供了新的治療靶點，也為是否采用胰島素治療提供新的理論依據(jù)。
　　第二部 胰島素抵抗與雌激素受體α甲基化在冠心病患者中的相關(guān)性研究
　　目的：
　　明確胰島素抵抗與ER-α基因甲基化在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的相關(guān)性。
　　方法：
　　1.選取解放軍第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院2

10、014年12月-2016年6月期間經(jīng)冠脈造影術(shù)確診為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，伴有或不伴胰島素抵抗的患者共96人，排除伴有腦、肝、腎等重要器官嚴重病變的患者。采集年齡、性別、長期吸煙史、主要合并癥等一般臨床資料，并檢測血糖、血脂、肝腎功、胰島素水平等生化指標，根據(jù)HOMA-IR分為胰島素抵抗組及非胰島素抵抗組。
　　2.入選患者采集肘靜脈血，提取全血基因組DNA，采用甲基化質(zhì)譜檢測技術(shù)檢測基因組ER-α甲基化水平。
　　3.

11、統(tǒng)計分析伴有胰島素抵抗和不伴胰島素抵抗的冠心病患者基因組ER-α甲基化水平，并分析HOMA-IR、年齡及性別對ER-α甲基化水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.入選的兩組患者在年齡、性別比、吸煙史、空腹血糖、血脂、肝腎功及主要合并癥之間無顯著差異。胰島素組患者的血漿胰島素水平及HOMA-IR顯著高于非胰島素抵抗組。
　　2.甲基化質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示，伴有胰島素抵抗的冠心病患者的基因組ER-α第一外顯子甲基化水平顯著高于對照

12、組。
　　3.伴有胰島素抵抗的冠心病患者的基因組ER-α甲基化水平隨HOMA-IR的增加而增加。
　　4.胰島素抵抗組及非胰島素抵抗組患者的基因組ER-α甲基化水平均隨年齡的增加而增加，而非胰島素抵抗組患者ER-α甲基化水平與年齡的相關(guān)性較胰島素組更加顯著。
　　5.胰島素抵抗組及非胰島素抵抗組男、女患者之間的基因組ER-α甲基化水平無顯著差異。
　　結(jié)論：
　　比較伴有胰島素抵抗或不伴胰島素抵抗的冠心病患