凡納濱對蝦鈣蛋白酶M、B和D基因的克隆及生物信息學(xué)分析.pdf

1、凡納濱對蝦是我國重要的對蝦養(yǎng)殖品種，對蝦的生長速度直接決定養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益。對蝦幼體到成體的肌肉生長速度取決于肌蛋白的合成速度和降解速度。研究發(fā)現(xiàn)，肌細胞肌原纖維的降解是由鈣蛋白酶引起的，鈣蛋白酶系統(tǒng)的鈣蛋白酶抑制蛋白可以抑制肌細胞的分解，肌蛋白降解速度相對降低會導(dǎo)致肌肉生長速度的增加，也會提高攝入營養(yǎng)物質(zhì)的肌肉轉(zhuǎn)化效率。
　　 本研究通過RACE方法克隆了凡納濱對蝦的鈣蛋白酶B(Calpains，Calp-B)、鈣蛋白酶D(Ca

2、lpains，Calp-D)、鈣蛋白酶M(Calpains，Calp-M)基因的部分序列，并對3個基因的序列進行了分析。結(jié)果如下:
　　 1.首次克隆獲得了凡納濱對蝦的Calp-M基因，通過設(shè)計簡并引物，從凡納濱對蝦的肌肉組織中獲得該基因，其cDNA序列長度為597bp，有一個507bp的開放閱讀框(ORF)，編碼169個氨基酸，通過氨基酸序列比對得知，凡納濱對蝦Calp-M編碼氨基酸的序列高度保守，與其他物種的相似性很高，達到

3、27.81％，因此確定該基因為凡納濱對蝦的Calp-M基因。Calp-M屬于親水性蛋白，Calp-M蛋白理論等電點為4.656，分子量為19.350KDa。其NC值為46.54，α-螺旋區(qū)域(Alpha helix)占18.34％;β-折疊區(qū)域(Extendedstrand)27.81％;無規(guī)則卷曲區(qū)域(Random coil)53.85％;其發(fā)生磷酸化的激活位點分別為11個絲氨酸(Ser)位點、7個蘇氨酸(Thr)位點、6個酪氨酸(T

4、yr)位點。
　　 2.克隆獲得了凡納濱對蝦Calp-B基因，用RACE的方法獲得了長度為1739bp的cDNA序列，921bp的開放閱讀框，編碼307個氨基酸，分子量為35.732KDa，等電點為6.502，該蛋白的氨基酸序列中含有39個堿性氨基酸，45個酸性氨基酸，96個疏水性氨基酸，63個極性氨基酸。通過氨基酸序列比對得知，凡納濱對蝦的Calp-B編碼氨基酸的序列高度保守。對凡納濱對蝦Calp-B氨基酸預(yù)測到該蛋白含有1個

5、完整的結(jié)構(gòu)域，組成的4個結(jié)構(gòu)域從N端起分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ結(jié)構(gòu)域。四個區(qū)域均可能存在1個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，1個N-糖基化位點，7個區(qū)域均為蛋白激酶C磷酸化位點，4個N-肉豆蔻酰，其中磷酸化位點和磷脂結(jié)合域。其結(jié)構(gòu)域Ⅳ含有EF-手結(jié)構(gòu)，與鈣離子結(jié)合，調(diào)節(jié)其它生物活性。而通過對其信號肽分析得知，Calp-B是一種分泌蛋白，并且信號肽切割為點在33aa處，其跨膜區(qū)域，對其功能的發(fā)揮有一定的作用，Calp-B蛋白的二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋區(qū)

6、域(Alpha helix)是由99個氨基酸組成，占32.25％;β-折疊區(qū)域(Extended strand)是由63個氨基酸組成，占20.52％;無規(guī)則卷曲區(qū)域(Random coil)是由145個氨基酸組成，占47.23％。NC值為49.744，由此表明Calp-B為一種表達量不是很高的內(nèi)源性基因。
　　 3.首次獲得凡納濱對蝦體內(nèi)Calp-D基因的部分cDNA的序列，其cDNA序列長度為623bp，其編碼了307個氨基酸

7、的蛋白前體，分子量為9.082K Da，等電點為5.522，該蛋白的氨基酸序列中含有9個堿性氨基酸，12個酸性氨基酸，26個疏水性氨基酸，15個極性氨基酸;Calp-D屬于親水性蛋白，通過生物信息學(xué)分析得知:Calp-D能存在1個氨酸激酶磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、N-糖基化位點、蛋白激酶C磷酸化位點、N-肉豆蔻酰位點和細胞粘附位點。NC值為50.331，表明Calp-D表達量不是很高的內(nèi)源性基因，數(shù)據(jù)分析得知無規(guī)則螺旋占據(jù)大多