類芽孢桿菌屬菌株產(chǎn)生淀粉酶的分離純化及對淀粉結(jié)合域CBM25的初步研究.pdf

1、由于近年來石油價格不斷攀升，各個國家和實驗室都在尋找高效的可再生能源來取代石油這一高耗費的能源，比如利用木薯、馬鈴薯淀粉等來生產(chǎn)燃料乙醇。工業(yè)上，淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟切枰?jīng)過液化和糖化兩個步驟，這就要求對淀粉原料進行高溫蒸煮?；跍p少能源消耗和有效利用天然資源的原則，廣大科研人員特別關(guān)注生淀粉的生物能轉(zhuǎn)化過程，并對能降解生淀粉的酶類進行研究。
　　 本研究通過多次連續(xù)富集培養(yǎng)，從廣西武鳴縣某淀粉廠附近篩選分離到一株具有較強水解生淀粉

2、能力的細菌，該菌株革蘭氏染色陽性，細胞呈桿狀，芽孢為橢圓形。經(jīng)過16SrDNA序列分析，初步鑒定該菌株為類芽孢桿菌屬Paenibacillussp.，命名為Paenibacillussp.WN61。該菌株液體搖瓶發(fā)酵70h后，生淀粉酶活力達到108.5U/mL，RDA值為57.8％，對木薯生淀粉的吸附率為70.26％，表現(xiàn)出對生淀粉具有較強的降解能力。
　　 通過飽和(NH4)2S04沉淀、SephacrylS-300層析的方法

3、對Paenibacillussp.WN61所產(chǎn)的生淀粉酶進行分離純化，得到純化的酶蛋白比活力為5112.04U/mg，純化倍數(shù)為14.1，相對分子質(zhì)量約為100kDa。該酶以木薯生淀粉為底物時，最適pH值為5.6，最適溫度為50℃。金屬離子Ca2+、Mg2+對該酶具有激活作用，Zn2+、Cu2+、Fe2+、Ni2+、Mnz+、C02+和EDTA對該酶均具有抑制作用。以可溶性淀粉為底物時，該酶的Km值為0.9059mg/mL，Vmax為2

4、59.0umol/mL·min。利用高效液相色譜分析其水解產(chǎn)物，包括麥芽糖、葡萄糖和麥芽三糖，推測該生淀粉酶是一種a-淀粉酶。
　　 在各種淀粉酶中，大約只有10％的淀粉酶能結(jié)合并降解生淀粉，它們通常具有一個明顯的序列結(jié)構(gòu)模塊，即淀粉結(jié)合域(SBD)。CBM25是淀粉結(jié)合域中的一類。從土壤富集宏基因組DNA中擴增到不包含和包含淀粉結(jié)合域CBM25的B.polymyxaβ-淀粉酶基因，并成功表達至pSE380載體上，獲得重組質(zhì)粒p

5、SE380-B-amy1和pSE380-B-amy2，以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主細胞大量表達融合的蛋白。利用鎳離子親和層析柱對BL21（DE3)/pSE380-B-amy1和BL21(DE3)/pSE380-B-amy2表達的重組蛋白進行純化，SDS-PAGE凝膠電泳表明獲得的純化蛋白相對分子質(zhì)量分別為46kDa和68kDa。酶學性質(zhì)研究表明，它們的最適溫度均為50℃，最適pH值均為7.0。B-AMY1的Km、Vmax和比活力分