大腸癌患者血清腫瘤標(biāo)志物的篩選及其功能研究.pdf

1、大腸癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第二位主要原因。大腸癌患者的預(yù)后與腫瘤的臨床分期關(guān)系密切，由于大腸癌患者早期常常無(wú)明顯癥狀，大多數(shù)大腸癌患者確診時(shí)已是晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)機(jī)，確診后即使行積極的根治性切除術(shù)，約60％的患者仍會(huì)發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。在過(guò)去的幾年中，由于大腸癌篩查的較廣泛應(yīng)用和治療模式的改善，大腸癌患者的生存率不斷提高。另一方面，大腸癌的發(fā)病率與生活方式和膳食結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。隨著人

2、們生活水平的提高，生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的改變以及人們預(yù)期壽命的增加，大腸癌的發(fā)病率也進(jìn)一步提高，且有逐漸年輕化的趨勢(shì)。及早發(fā)現(xiàn)大腸癌及其癌前病變，并行積極的干預(yù)治療，是降低大腸癌發(fā)病率、提高患者生存率、延長(zhǎng)患者生存時(shí)間的關(guān)鍵。因此，大腸癌的早期篩查具有十分重要的意義。
　　目前，大腸癌篩查的主要手段包括高靈敏度的糞便潛血試驗(yàn)和結(jié)腸鏡檢查。糞便潛血試驗(yàn)檢測(cè)性能好、成本低、且病人無(wú)痛苦、無(wú)損傷性，是目前應(yīng)用最廣泛的大腸癌篩查方法。但糞便

3、潛血試驗(yàn)特異性差、敏感性低。在許多其他疾病，如消化性潰瘍、上消化道出血等疾病中，糞便潛血試驗(yàn)的結(jié)果也可能陽(yáng)性，從而使一些非腫瘤患者最初診治時(shí)誤以為是腫瘤，給患者帶來(lái)較大心理壓力及后續(xù)繁瑣的檢查，消耗患者大量精力及財(cái)力。另一方面，只有當(dāng)出血量達(dá)到一定量時(shí)，才能在糞便中檢測(cè)到潛血，因此通過(guò)糞便潛血試驗(yàn)陽(yáng)性檢測(cè)出的多為晚期大腸癌患者。
　　結(jié)腸鏡檢查是目前大腸癌篩查最有效的手段，是大腸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。在美國(guó)，由于結(jié)腸鏡篩查的逐步應(yīng)用，5

4、0歲及以上成人大腸癌的發(fā)病率顯著下降。但結(jié)腸鏡檢查程序復(fù)雜，價(jià)格昂貴，且普通結(jié)腸鏡檢查病人非常痛苦，有心臟病及凝血功能障礙等疾病的患者不能進(jìn)行結(jié)腸癌檢查，約三分之一的患者由于耐受性差放棄結(jié)腸鏡檢查。因此，結(jié)腸鏡檢查限制較多，不適合在無(wú)癥狀人群中直接開(kāi)展結(jié)腸鏡篩查。
　　血清腫瘤標(biāo)志物是可用于癌癥患者檢測(cè)的一種簡(jiǎn)易方法，在臨床上已有較普遍應(yīng)用。癌胚抗原(CEA)和糖類抗原199(CA199)是目前最常用的大腸癌血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物。然而

5、CEA和CA199在許多其他惡性腫瘤患者血清水平也有升高，對(duì)大腸癌診斷的特異性不高，且在早期大腸癌診斷中意義有限。開(kāi)發(fā)、選擇新的高靈敏度和高特異性的大腸癌血清腫瘤標(biāo)志物具有重大的意義。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)是鑒定新的腫瘤標(biāo)志物或腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中關(guān)鍵蛋白的有效方法，在腫瘤標(biāo)志物的發(fā)掘方面具有重大的意義?？贵w芯片是蛋白芯片的一種，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有效工具。該研究中使用人細(xì)胞因子抗體芯片同時(shí)檢測(cè)274種細(xì)胞因子在大腸癌患者與正常對(duì)照

6、組人群血清中的表達(dá)，為大腸癌早期篩查篩選出新的異常表達(dá)蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行ELISA驗(yàn)證，從而為大腸癌的早期篩查提供新的腫瘤標(biāo)志物CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB;通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)一步研究這些腫瘤標(biāo)志物在大腸癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，探索其在大腸癌發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后判斷、靶向治療及療效評(píng)估中的意義。
　　研究目的:
　　1、檢測(cè)大腸癌患者與正常對(duì)照人群血清中蛋白質(zhì)的表

7、達(dá)，篩選出大腸癌患者血清中高表達(dá)的蛋白質(zhì)，為大腸癌的早期篩查提供新的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物。
　　2、檢測(cè)大腸癌腫瘤組織及其對(duì)應(yīng)的正常大腸粘膜組織中差異蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后判斷中的意義。
　　材料和方法:
　　1、選取5例大腸癌患者術(shù)前血清及正常對(duì)照人群血清，應(yīng)用RayBio公司的人細(xì)胞因子抗體芯片G-4000(AAH-CYT-G4000)篩選出大腸癌患者與正常對(duì)照

8、人群血清中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。
　　2、選取抗體芯片大腸癌患者血清中差異高表達(dá)的蛋白質(zhì)，擴(kuò)大樣本量，在30例大腸癌患者血清中進(jìn)行ELISA驗(yàn)證及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析其在大腸癌早期診斷中的價(jià)值，篩選出大腸癌早期診斷新的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物。
　　3、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)大腸癌及其對(duì)應(yīng)正常大腸粘膜石蠟組織中差異蛋白質(zhì)的表達(dá)，分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討其在大腸癌發(fā)生、發(fā)展、治療以及預(yù)后判斷中的意義，為大腸癌靶向治療及預(yù)后判斷

9、提供新的生物學(xué)靶點(diǎn)。
　　結(jié)果:
　　1、AAH-CYT-G4000抗體芯片檢測(cè)274種蛋白質(zhì)在大腸癌患者及正常對(duì)照人群血清中的表達(dá)，以P＜0.05定義為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并計(jì)算各細(xì)胞因子的倍數(shù)改變以顯示它們的相對(duì)表達(dá)水平，任何倍數(shù)改變≥1.5或≤1/1.5的信號(hào)強(qiáng)度認(rèn)為有重大意義。蛋白芯片結(jié)果顯示大腸癌患者及正常對(duì)照人群血清中有94種蛋白質(zhì)差異表達(dá)，其中有66種蛋白質(zhì)在大腸癌患者血清明顯高表達(dá)，包括AFP、IL-17R、

10、Cripto-1、CA199、CALCA、DKK-4、TG、CEACAM1、CEA、41BB、HER2/ErbB2、CDH1、IL-17F、Ubiquitin、NGF R、ANGPTL4、Angiostatin、CCL14、TGF beta2、CA9、BMP-5、CTSS、GDF-15、FSH、CD23、S-100b、TRAIL R2、VCAM-1, CA125, DKK-1, IP-10, beta2 M, MDC, DR6(TNFR

11、SF21), Fas Ligand,LIF、Shh N、IL-2 Rbeta、TIMP-4、CRP、Adiposin, sgp130、hCG intact、HVEM、CA15-3、BMP-7、IL-13 R alpha1、LYVE-1、MMP-9、TNF-beta、IL-9、NAP-2、MIP-1 delta、ErbB3、PSA-free、IL-6、IL-18 Bpalpha、CD40 Ligand、NID1、IL-3、IL-1alph

12、a、CXCL-16、Angiogenin、ALCAM、FSTN、BCAM。28種蛋白質(zhì)在大腸癌患者血清明顯低表達(dá)，包括IGFBP-2、VEGF R3、Insulin、Resistin、PDGFRbeta、VEGF R2、TREM-1、SCF R、TIMP-2、CD30、PDGF-BB、ICAM-2、Osteoprotegerin、PSA-total、TSH-β、Upar、Stnf RⅡ、EGF-R、MMP-3、L-Selectin、Si

13、l-6 R、MICB、E-Selectin, Axl, HCC-4, TRAIL R3, Stnf-RI, MSP-alpha。
　　2、ELISA驗(yàn)證大腸癌患者血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示大腸癌患者血清中CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB蛋白水平明顯高于正常對(duì)照人群，這4種蛋白質(zhì)在大腸癌診斷中的價(jià)值均大于0.7，具有較高的敏感性及特異性，可以作為大腸癌篩查新的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物。
　　3、免疫組織化學(xué)驗(yàn)

14、證CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB在大腸癌組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB在大腸癌腫瘤細(xì)胞中均呈陽(yáng)性高表達(dá)。CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB的高表達(dá)與臨床分期相關(guān)，CEACAM1、Cripto-1和VCAM-1的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1、抗體芯片可以同時(shí)、高效地檢測(cè)多種蛋白質(zhì)在腫瘤患者血清中的表達(dá)，是一種較好的腫

15、瘤標(biāo)志物篩選手段。
　　2、CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB在大腸癌患者血清中高表達(dá)，檢測(cè)血清中CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB水平有助于早期、無(wú)創(chuàng)地發(fā)現(xiàn)大腸癌患者，可以作為大腸癌早期篩查新的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物。
　　3、CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB在大腸癌腫瘤組織中高表達(dá)，且與腫瘤的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，檢測(cè)大腸癌腫瘤組織中CEACAM1、Cri

16、pto-1、VCAM-1和41BB的表達(dá)有助于判斷大腸癌患者的預(yù)后，并可能成為大腸癌患者靶向治療的新靶點(diǎn)。
　　本研究的創(chuàng)新之處:
　　1、應(yīng)用AAH-CYT-G4000抗體芯片同時(shí)檢測(cè)大腸癌患者與正常對(duì)照人群血清中274種細(xì)胞因子的表達(dá)，為大腸癌早期篩查提供新的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物，通過(guò)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行ELISA驗(yàn)證及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，篩選出大腸癌新的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB，為大腸癌早