腫瘤標(biāo)志物核酸適體的篩選及其應(yīng)用.pdf

1、核酸適體作為一種新型的分子識別工具,與傳統(tǒng)的抗體相比不僅具有高度的親和力與特異性,還具有易合成、易修飾、穩(wěn)定性好等優(yōu)點,在蛋白質(zhì)研究中顯示出了良好的應(yīng)用潛力。特別是在檢測、分析腫瘤生物標(biāo)記物的研究中,可以通過SELEX技術(shù)簡便快速的獲得其高親和力和特異性的核酸適體,從而避免了復(fù)雜耗時的抗體制備過程。更為重要的是利用核酸適體可以實現(xiàn)對這些腫瘤生物標(biāo)記物的特異靈敏檢測,然而,當(dāng)前報道的針對腫瘤標(biāo)志物的核酸適體數(shù)量極少,可用于臨床檢測與治療的

2、更是屈指可數(shù)。因此開展核酸適體篩選,獲得新型腫瘤標(biāo)志物的核酸適體序列對于癌癥的早期診斷和治療具有非常重要的科學(xué)意義和臨床價值。從該思路出發(fā),本文開展了以下三方面的工作:
　　 1.AGR2核酸適體的篩選及應(yīng)用
　　 AGR2最初是在非洲爪蟾外胚層發(fā)現(xiàn)的促分泌因子。臨床研究表明AGR2在多種人類腫瘤中過量表達,如食道癌、前列腺癌、乳腺癌,肺癌和胰腺癌。更多的生物學(xué)研究證明AGR2在腫瘤增殖,細(xì)胞遷移,肢體再生及代謝過程中發(fā)

3、揮重要作用。然而導(dǎo)致AGR2在人體細(xì)胞發(fā)揮其生物功能的機理目前尚不清楚。因此發(fā)展一種高靈敏識別AGR2的分子探針,對研究AGR2的分子機理以及臨床檢測AGR2無疑具有重大意義。
　　 本文以重組的AGR2-GST融合蛋白作為靶蛋白,經(jīng)過14輪篩選,獲得了4條與靶蛋白AGR2高特異性與高親和力結(jié)合的單鏈DNA核酸適體,以其中最優(yōu)的一條核酸適體C14B作為研究對象進行了序列優(yōu)化,得到了僅33 mer的核酸適體C1481,其解離常數(shù)腸

4、達到19 nM。圓二色譜法以及溶解曲線測定的結(jié)果顯示核酸適體C1481形成了一個鏈內(nèi)平行的G四聚體結(jié)構(gòu),該四聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性強烈依賴于K+的存在,并且K+可以通過影響核酸適體G四聚體的結(jié)構(gòu)進而影響其與靶蛋白的結(jié)合功能。在進一步研究中,本文以C14B1這條序列為基礎(chǔ)設(shè)計了一種基于構(gòu)象變化特異性檢測AGR2的變構(gòu)分子探針AGR2-aMB,其檢測下限可以達到50 nM。這種分子探針為生物醫(yī)學(xué)中研究AGR2在腫瘤發(fā)生中的分子機理以及臨床中檢測A

5、GR2蛋白為標(biāo)準(zhǔn)的腺體癌類早期診斷和預(yù)警提供了一種新方法。
　　 2.SRC-3核酸適體的篩選及應(yīng)用
　　 SRC-3(Steroid receptor coactivator3),是p160共激活子家族的一員。SRC-3被報道在多種腫瘤的惡化過程中起到重要的作用。SRC-3在68％的肝癌中過表達并且能促進肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲,成瘤。很多研究小組將SRC-3直接看作是癌基因,且抑制SRC-3的轉(zhuǎn)錄促激活活性是肝癌治療的有

6、效方法。值得注意的是在SRC-3的轉(zhuǎn)錄促激活過程中,SRC-3的CID結(jié)構(gòu)域?qū)τ贑BP/p300的募集是SRC-3保持轉(zhuǎn)錄促活性的必須環(huán)節(jié),因此如果可以篩選獲得特異性和SRC-3的CID結(jié)構(gòu)域結(jié)合的核酸適體,設(shè)計出具有功能化的核酸探針,即可潛在的實現(xiàn)靶向的抑制SRC-3募集CBP/p300的作用,從而實現(xiàn)對SRC-3轉(zhuǎn)錄促激活活性的抑制,為肝癌治療提供新的思路和方法。
　　 本文以SRC-3重要的CBP/p300募集結(jié)構(gòu)域CID

7、為靶標(biāo)。構(gòu)建質(zhì)粒并獲得CID-flag融合蛋白,經(jīng)過12輪篩選,獲得了8條與靶蛋白CID高特異性高親和力結(jié)合的單鏈DNA核酸適體,以其中最優(yōu)的一條核酸適體CID＃23作為研究對象,探究了其與SRC-3的五個不同結(jié)構(gòu)的結(jié)合情況,實驗證明CID#23可以和CID及S/T兩個結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。并在后續(xù)實驗中證明了CID#23可以與SRC-3以及其同源蛋白SRC-1和SRC-2結(jié)合。在體外的免疫共沉淀生化實驗結(jié)果表明CID#23可以抑制SRC3對C

8、BP/p300的募集作用。因此證明CID#23可以成為一種潛在的治療肝癌的藥物。
　　 3.變構(gòu)分子探針檢測蛋白質(zhì)和生物小分子的研究
　　 近年來,結(jié)合核酸適體的分子特性,將蛋白質(zhì)和生物小分子的檢測轉(zhuǎn)換為特異識別的核酸適體的檢測,對疾病的預(yù)測和醫(yī)學(xué)的診斷都具有重要的意義。發(fā)展并完善核酸適體檢測的方法,使其更加快速、靈敏、準(zhǔn)確和方便,是目前研究的熱點之一。發(fā)展并完善核酸適體檢測的方法,使其更加快速、靈敏、準(zhǔn)確和方便,是目前

9、研究的熱點之一。
　　 在自然界中,蛋白的結(jié)合能力以及酶活性都會有效的受到效應(yīng)分子與其變構(gòu)位點結(jié)合的調(diào)節(jié)。受此啟發(fā),本文設(shè)計了一種變構(gòu)探針。它的工作原理是依靠靶標(biāo)分子活化探針的鏈霉親和素結(jié)合位點,改變探針構(gòu)象使標(biāo)有熒光的探針分子與靶標(biāo)復(fù)合物結(jié)合到鏈霉親和素微球之上,使用流式細(xì)胞儀進行檢測。這種方法的最大優(yōu)點在于鏈霉親和素微球在將靶標(biāo)與探針分子富集的同時可以有效的排除溶液體系中游離的探針背景信號,進而獲得超高的信背比。利用這種方法