新腫瘤標(biāo)志物的篩選及功能初步研究.pdf

1、第一章腫瘤標(biāo)志物的生物信息學(xué)篩選及其表達(dá)譜初步分析 目的：采用生物信息學(xué)方法篩選腫瘤差異表達(dá)基因，并對(duì)篩選得到的結(jié)果進(jìn)行表達(dá)譜初步分析。 方法：利用CGAP網(wǎng)站提供的cDNAx Profiler工具，以人類正常組織和腫瘤組織EST數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，篩選腫瘤差異表達(dá)基因，并對(duì)篩選得到的68個(gè)基因進(jìn)行染色體定位。采用電子雜交以及RT-PCR的方法對(duì)篩選得到的結(jié)果進(jìn)行表達(dá)譜初步分析。 結(jié)果：通過生物信息學(xué)篩選得到在腫瘤組織

2、中特異性表達(dá)的基因或EST片段2801個(gè)，其中已知基因68個(gè)，未知基因2733個(gè)。在這68個(gè)已知基因中，40個(gè)基因的功能已基本明確。在這40個(gè)基因中5個(gè)基因已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)為腫瘤特異性基因，占12.5％。對(duì)篩選得到的68個(gè)基因進(jìn)行染色體定位，發(fā)現(xiàn)在7號(hào)和10號(hào)染色體上篩選得到的腫瘤特異性基因較少，而在8號(hào)、21號(hào)以及X染色體中腫瘤特異性基因出現(xiàn)的頻率明顯多于其他染色體。進(jìn)一步對(duì)篩選得到的2801個(gè)腫瘤特異性表達(dá)基因或EST片段進(jìn)行電子雜交分

3、析，9個(gè)基因結(jié)果較理想。RT-PCR檢測(cè)這9個(gè)基因在不同細(xì)胞株中的表達(dá)，7個(gè)基因在被檢測(cè)的11個(gè)細(xì)胞株中未得到目的片段，而GABRA3基因與HTA基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)特異。 結(jié)論：生物信息學(xué)篩選腫瘤差異表達(dá)基因是一種高效的方法。腫瘤特異性基因在某些染色體上相對(duì)“活躍”。 第二章GABRA3基因的表達(dá)譜分析及功能研究 目的：對(duì)GABRA3基因進(jìn)行表達(dá)譜分析及功能初步研究。檢測(cè)GABAA受體各亞單位在腫瘤組織中的表達(dá)

4、。 方法：采用RT-PCR以及免疫組化法分析GABRA3的表達(dá)譜。通過RNAi以及藥物處理對(duì)GABRA3基因的功能進(jìn)行初步研究。 結(jié)果：在被檢測(cè)的11株細(xì)胞株中，GABRA3基因在肝癌細(xì)胞株HepG2，乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，MDA-MB-231和膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中表達(dá)，而在其他腫瘤細(xì)胞株以及正常細(xì)胞株中無表達(dá)。在被檢測(cè)的20種正常組織中，該基因除在腦組織，子宮內(nèi)膜，胎盤以及前列腺中有表達(dá)外，在其他正常組織中均未被檢

5、測(cè)到。在18例新鮮肺癌組織標(biāo)本中GABRA3表達(dá)陽性率為66.67％，而對(duì)應(yīng)的18例肺癌癌旁組織中均未檢測(cè)到該基因。采用免疫組化的方法，分析GABRA3在60例肺癌及10例癌旁組織中的表達(dá)。10例癌旁組織均未染色，而60例肺癌組織標(biāo)本中GABRA3蛋白表達(dá)的陽性率為41.67％，肺癌組織中細(xì)胞陽性染色主要見于胞質(zhì)和胞膜。通過對(duì)GABRA3蛋白在肺癌組織中表達(dá)量與臨床資料的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)GABRA3蛋白的表達(dá)量肺癌的病理分級(jí)密切相關(guān)(p

6、<0.05)。隨著腫瘤惡性程度的增高，GABRA3蛋白表達(dá)的陽性率和表達(dá)量有增高的趨勢(shì)。在8例肝癌組織標(biāo)本中，共6例表達(dá)GABRA3基因，陽性率為65％。而在所有對(duì)應(yīng)的癌旁組織中均未擴(kuò)增得到該基因目的片斷。在肺癌和肝癌組織中，還檢測(cè)了GABAA受體其他亞單位的表達(dá)情況，除a3亞單位外還有GABAA受體α6、β3、γ2、δ、θ、ε和π亞單位的表達(dá)。 在肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞中，檢測(cè)到GABA生成過程中的關(guān)鍵酶GAD67表達(dá)。通過

7、細(xì)胞增殖能力研究發(fā)現(xiàn)，GABA對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2具有促增殖的作用。當(dāng)GABRA3基因被沉默后HepG2細(xì)胞的增殖能力明顯降低。對(duì)GABRA3基因被沉默的HepG2細(xì)胞給予GABA藥物處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其增殖能力非但沒有增強(qiáng)，反而有減弱的趨勢(shì)。 結(jié)論：GABRA3基因在肺癌和肝癌中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)量與腫瘤的分化程度密切相關(guān)。在肝癌中，肝癌細(xì)胞可經(jīng)GAD67催化產(chǎn)生GABA；GABA發(fā)揮了促腫瘤細(xì)胞增殖的作用，其作用是通過上調(diào)表達(dá)的

8、GABRA3介導(dǎo)的。除GABRA3外，肝癌和肺癌組織中還有GABAA受體其他亞單位的表達(dá)，當(dāng)GABRA3被沉默時(shí)，GABA通過這些亞單位發(fā)揮了抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。 第三章HTA基因的表達(dá)譜分析及功能研究 目的：對(duì)HTA基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對(duì)該基因進(jìn)行表達(dá)譜分析及功能初步研究。 方法：采用RT-PCR法分析HTA基因的表達(dá)譜，通過RNAi對(duì)該基因的功能進(jìn)行初步研究，采用各種在線工具軟件對(duì)該基因進(jìn)行生物信息

9、學(xué)分析。 結(jié)果：通過RT-PCR檢測(cè)到HTA基因在人肝癌細(xì)胞株HepG2以及多種腫瘤組織中表達(dá)，在肝癌中表達(dá)陽性率較高，而在正常肝細(xì)胞株L-O以及20種正常組織標(biāo)本均無表達(dá)。采用RNAi技術(shù)抑制HTA基因在肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)，通過細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞倍增時(shí)間、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)以及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，HTA基因被沉默后HepG2細(xì)胞的增殖能力降低。經(jīng)生物信息學(xué)分析，HTA定位于人類染色體16q22.3，包含