神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1β及其受體信號系統(tǒng)對心肌細(xì)胞的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、尋求新的保護(hù)因子或新的治療策略對心肌細(xì)胞(cardiac muscle cell，CM)的保護(hù)作用及其機(jī)制對于心臟疾病的治療和改善心功能具有重要的意義。雖然對心肌細(xì)胞肥大和心室重構(gòu)的研究取得了許多重大的突破性進(jìn)展，但這眾多的研究成果大多是基于心肌細(xì)胞或心室結(jié)構(gòu)本身而開展的，而對心臟神經(jīng)調(diào)控機(jī)制對心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響尚有待于從更廣和更深的層次開展研究。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1β(neuregulin-1β，NRG-1β)可通過激活其酪氨酸激酶

2、受體ErbB2和ErbB4而對神經(jīng)元發(fā)揮多種調(diào)控作用，NRG-1β很可能具備對心臟神經(jīng)發(fā)揮特有的調(diào)控作用的潛能，到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)NRG-1β通過調(diào)控心臟神經(jīng)而對心肌發(fā)揮調(diào)控作用的報(bào)道。有趣的是，NRG-1β還可對心肌細(xì)胞直接發(fā)揮重要的調(diào)控功能。鑒于心臟神經(jīng)和心肌細(xì)胞均為NRG-1β直接調(diào)控的靶組織，這將使NRG-1β對心功能的調(diào)節(jié)作用機(jī)制更為復(fù)雜。本課題將基于以上研究背景開展如下一系列實(shí)驗(yàn)研究:首先，研究NRG-1β對培養(yǎng)的新生大

3、鼠心肌細(xì)胞的ErbB2和ErbB4受體及其下游的磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，Akt)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellularsignal-regulated kinase1/2，ERK1/2)的表達(dá)及其激活的影響作用;其次，研究NRG-1β及其相關(guān)的信號通路對心肌細(xì)胞重要的形態(tài)指標(biāo)和功能指標(biāo)的影響作用;最終，利用具

4、有選擇性交感神經(jīng)支配的心肌細(xì)胞，研究NRG-1β及其相關(guān)的信號通路對神經(jīng)和心肌的雙重調(diào)控作用。通過以上系列研究，以便進(jìn)一步闡明NRG-1β直接調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞或通過調(diào)節(jié)其神經(jīng)支配而調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的作用及其機(jī)制。從而提出不僅通過NRG-1β及其受體信號的活性而直接增強(qiáng)心肌細(xì)胞再生能力或功能，而且還可通過NRG-1β及其受體信號系統(tǒng)介導(dǎo)的心臟神經(jīng)調(diào)控作用而進(jìn)一步增強(qiáng)其對心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控作用的新的治療策略。
　　第一部分：神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白

5、-1β在心肌細(xì)胞激活其受體及其下游信號通路的實(shí)驗(yàn)研究
　　NRG-1β對心肌細(xì)胞ErbB2和ErbB4受體及其下游的PI3K/Akt和ERK1/2的激活是其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要途徑。為了研究NRG-1β對心肌細(xì)胞ErbB2和ErbB4受體及其下游的信號分子Akt和ERK1/2表達(dá)及其激活的影響作用，本課題利用培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞觀察了NRG-1β快速孵育和持續(xù)孵育對這些分子表達(dá)和激活的影響作用程度。結(jié)果顯示，NRG-1β急性孵育

6、不會(huì)對心肌細(xì)胞表面積產(chǎn)生影響，而NRG-1β持續(xù)孵育，則可增加心肌細(xì)胞的表面積，有利于心肌細(xì)胞的生長發(fā)育;NRG-1β急性孵育雖然不能促進(jìn)其受體ErbB2和ErbB4及其下游信號分子Akt和ERK1/2的表達(dá)，但可顯著提高其磷酸化水平，表明NRG-1β急性孵育可激活其受體及其相關(guān)的下游細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;NRG-1β持續(xù)孵育不僅能促進(jìn)其受體ErbB2和ErbB4及其下游信號分子Akt和ERK1/2的表達(dá)，而且還使其磷酸化水平顯著上升，從而

7、改善心肌細(xì)胞的生長狀態(tài);NRG-1β的促心肌細(xì)胞生長效應(yīng)可被PI3K抑制劑LY294002或ERK1/2抑制劑PD98059所阻斷，而不能阻斷NRG-1β的誘導(dǎo)其受體ErbB2和ErbB4表達(dá)和磷酸化的效應(yīng)。以上結(jié)果表明，NRG-1β急性孵育和NRG-1β持續(xù)孵育對心肌細(xì)胞具有不同的生物學(xué)效應(yīng)。NRG-1β急性孵育和NRG-1β持續(xù)孵育對其受體ErbB2和ErbB4及其下游信號分子Akt和ERK1/2表達(dá)和激活的不同生物學(xué)效應(yīng)揭示了將來

8、利用NRG-1β治療相應(yīng)的心臟疾患所可能采取的不同治療策略。
　　第二部分：神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1β改善心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)的作用
　　參與粗肌絲構(gòu)成的肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)、能夠激活調(diào)節(jié)性肌球蛋白輕鏈（myosin regulatory light chain，rMLC）的心肌特異的肌球蛋白輕鏈激酶（cardiac-specific myosin light-chain kinase，cM

9、LCK）是調(diào)節(jié)肌節(jié)組裝的重要因子，心肌細(xì)胞的主要門控通道L-型鈣通道(L-type calcium channel，LTCC，Cav1.2)是Ca2+進(jìn)入心肌細(xì)胞的主要通道，肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子三磷酸腺苷酶或肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子泵(sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+ ATPases or sarco(endo)plasmicreticulum-Ca2+ pump，SERCA2a)通過將胞質(zhì)內(nèi)Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)至肌質(zhì)網(wǎng)(sar

10、coplasmicreticulum，SR)內(nèi)，從而調(diào)節(jié)收縮和舒張循環(huán)的協(xié)調(diào)性。以上指標(biāo)是影響心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵因素，為了檢測NRG-1β對這些指標(biāo)的影響作用及其相關(guān)機(jī)制，本課題利用培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞，研究了NRG-1β及其相關(guān)的信號通路對心肌細(xì)胞的這些重要形態(tài)指標(biāo)和功能指標(biāo)的影響作用，并深入分析了NRG-1β改善心肌細(xì)胞內(nèi)在組分的潛能。結(jié)果顯示，NRG-1β可分別促進(jìn)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞代表性結(jié)構(gòu)指標(biāo)MHC、對心肌細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵激酶

11、cMLCK、代表性功能指標(biāo)L-型鈣通道和SERCA2a的表達(dá)，PI3K抑制劑LY294002或ERK1/2抑制劑PD98059可抑制NRG-1β引起的促心肌細(xì)胞MHC、cMLCK、L-型鈣通道和SERCA2a表達(dá)上調(diào)的作用。這些結(jié)果表明，NRG-1β可有效促進(jìn)對心肌細(xì)胞收縮的基本結(jié)構(gòu)分子和功能分子的表達(dá)，從而改善心肌細(xì)胞的內(nèi)在組分構(gòu)成，并由此而提高心肌細(xì)胞功能的潛在能力，這是NRG-1β將來有可能成為改善心功能的有效治療分子的重要實(shí)驗(yàn)依

12、據(jù)。
　　第三部分：神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1β增強(qiáng)心肌細(xì)胞去甲腺素能命運(yùn)的潛能
　　心肌細(xì)胞的去甲腎上腺素能命運(yùn)是保證和維持心肌細(xì)胞功能的前提，在此基礎(chǔ)上，心肌細(xì)胞的功能調(diào)控還有賴于正常交感神經(jīng)的支配。心肌細(xì)胞β-腎上腺素能受體（β-adrenergic receptor,β-AR）的表達(dá)是心肌細(xì)胞的去甲腎上腺素能命運(yùn)的重要體現(xiàn)，β-AR的激活是交感神經(jīng)支配信號傳遞的必由途經(jīng)。本課題將根據(jù)NRG-1β及其相關(guān)的信號通路對神經(jīng)和心肌的

13、雙重調(diào)控作用，建立器官型的頸上神經(jīng)節(jié)(superior cervical ganglion，SCG)組織塊和分散心肌細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)體系，研究有或沒有交感神經(jīng)支配的培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，再附加NRG-1β孵育的條件下，心肌細(xì)胞去甲腎上腺素能命運(yùn)潛能的變化。結(jié)果顯示，NRG-1β孵育可使心肌細(xì)胞β1-AR和β2-AR的表達(dá)水平上調(diào)，而選擇性交感神經(jīng)支配使心肌細(xì)胞β1-AR和β2-AR表達(dá)水平上調(diào)的效應(yīng)更加明顯，NRG-1β孵育可進(jìn)一步增強(qiáng)交感神經(jīng)

14、支配信號對心肌細(xì)胞β1-AR和β2-AR表達(dá)水平上調(diào)的促進(jìn)效應(yīng);在心肌細(xì)胞與交感神經(jīng)元聯(lián)合培養(yǎng)的過程中，應(yīng)用NRG-1β孵育能夠通過增加交感神經(jīng)元突起的數(shù)目增強(qiáng)交感神經(jīng)信號對心肌細(xì)胞支配的效能;PI3K抑制劑LY294002或ERK1/2抑制劑PD98059可抑制NRG-1β引起的促心肌細(xì)胞β1-AR和β2-AR表達(dá)上調(diào)作用和促神經(jīng)元突起生長的效應(yīng)。這些結(jié)果表明，NRG-1β具有進(jìn)一步增強(qiáng)交感神經(jīng)支配信號的促心肌細(xì)胞去甲腎上腺素能命運(yùn)的