黃精多糖的分離、鑒定及免疫調節(jié)功效研究.pdf

1、黃精是一種藥食同源的中藥材，其中含有多種對人體有益的活性成分。黃精多糖作為黃精的主要成分，具有多種生物活性，因此具有很高的應用價值。多糖是一種廣泛存在于動物和植物細胞中天然大分子物質，是構成生命的四大基本物質之一。研究表明，多糖具有抗腫瘤、調節(jié)血糖和血脂、抑菌和抗炎、調節(jié)免疫等作用，在功能食品、醫(yī)療保健方面具有良好的發(fā)展應用前景。近年來，中藥多糖的免疫調節(jié)作用成為研究熱點，取得了很大的進展。
　　雖然對黃精及其多糖的研究有不少文獻

2、報道，但大多集中在黃精多糖的提取分離純化，粗提物抑制腫瘤生長、調節(jié)血糖、改善記憶等功效的研究，而黃精多糖純提取物的結構鑒定及其免疫調節(jié)等生物活性的研究相對較少，并且從體內和體外實驗、細胞分子水平和基因水平闡明黃精多糖對細胞信號轉導途徑的調節(jié)及其交互作用，找出其關鍵環(huán)節(jié)，對于揭示生物學功能的發(fā)生機制具有重大意義。
　　巨噬絀胞作為一種免疫細胞，具有吞噬和介入炎癥反應的作用，它廣泛分布于機體不同組織中，在天然免疫中發(fā)揮著重要作用。近年

3、來，大量體內外研究證明，許多天然多糖具有調節(jié)巨噬細胞功能的作用。黃精多糖具有多種重要的生物學活性，其中最重要的就是免疫調節(jié)作用，其可以作為免疫調節(jié)劑，通過免疫調節(jié)來提升機體的免疫防御能力。
　　本課題有關黃精多糖的分離、鑒定及免疫調節(jié)功效的主要研究內容分為三部分:(1)黃精多糖的制備、純化、分離以及抗氧化性能評價，(2)黃精多糖在巨噬細胞RAW264.7體外免疫調節(jié)以及信號通路研究，(3)環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的體內免疫調節(jié)作用

4、及其機制。
　　黃精多糖的制備和評價研究內容包括提取、純化、分離以及抗氧化性能的考察。利用水提醇沉法將黃精多糖從黃精中提取出來，利用Sevage試劑脫蛋白、活性炭吸附法脫色，將所得到的黃精粗多糖進行純化。采用DEAE-Sepharose FastFlow離子交換色譜對黃精多糖進一步分離純化，得到四種組分，分別命名為PSP1、PSP2、PSP3、PSP4。采用紅外光譜和核磁共振分析對分離得到的黃精多糖進行初步結構鑒定，通過Size

5、exclusion chromatography測定了黃精多糖的分子量，通過HPLC柱前衍生化法測定了黃精多糖的單糖組成;體外抗氧化實驗表明，黃精多糖具有較好的自由基清除能力和還原能力。
　　黃精多糖體外免疫療效的考察由巨噬細胞RAW264.7吞噬能力、一氧化氮和細胞因子調節(jié)以及信號通路研究組成。本實驗選用的細胞模型為小鼠RAW264.7巨噬細胞系，利用中性紅實驗測定了巨噬細胞的吞噬能力，通過硝酸還原酶法測定細胞上清中的一氧化氮(

6、NO)含量，細胞因子IL-6和TNF-α的含量以及它們對應的mRNA的表達分別通過酶聯免疫吸附法和RT-PCR來測定。利用WesternBlot方法檢測了RAW264.7細胞中p38 MAPK、IκB-α、NF-κB p65、iNOS和COX-2的蛋白表達，并用免疫熒光法檢測了NF-κB p65的核轉移。結果表明黃精多糖可以促進巨噬細胞吞噬，增加NO、TNF-α和IL-6的分泌。在機制方面，黃精多糖促進了Iκ B-α降解，增強了p38

7、MAPK、NF-κB p65、iNOS和COX-2的表達，并呈良好的劑量依賴關系，同時提升了NF-κB的核轉移過程。實驗結果說明，黃精多糖具有明顯的免疫增強活性，進一步表明其有助于促進細胞介導免疫反應。
　　黃精多糖體內免疫調節(jié)作用研究包括:環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬能力，脾臟T和B淋巴細胞增殖能力，血清中細胞因子的免疫應答。采用環(huán)磷酰胺建造非特異性免疫功能低下的實驗動物模型，分別從免疫器官指數、免疫細胞（T淋巴細

8、胞、B淋巴細胞、腹腔巨噬細胞）活性以及細胞因子(TNF-α、IL-2、IL-8、IL-10)的變化等方面考察了黃精多糖免疫調節(jié)作用。結果表明:黃精多糖不但能夠提高免疫細胞的活性，同時還可以調節(jié)血清中TNF-α、IL-2、IL-8和IL-10等因子的水平，進而平衡Thl和Th2。換句話說，黃精多糖能夠提高機體免疫力。
　　綜上所述，本課題首先提取純化了黃精多糖并對其結構和理化性質進行了評價;巨噬細胞RAW264.7體外免疫活性實驗結