乳源免疫調(diào)節(jié)肽分離、純化與鑒定及其功能的初步研究.pdf

1、1.乳源免疫調(diào)節(jié)肽的制備、純化及鑒定 目的：探討酪蛋白酶解產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)肽的最適條件，建立酶解產(chǎn)物的分離及其鑒定免疫調(diào)節(jié)肽的方法。 方法：將酪蛋白酶解，其酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾膜過濾，用十二烷基磺酸鈉——聚丙烯酰銨凝膠電泳(SDS-PAGE)方法分析其酶解情況。用反相高效液相色譜層析(RP-HPLC)，C18柱，以免疫調(diào)節(jié)肽為標(biāo)準(zhǔn)已知樣，利用保留時間外標(biāo)法與內(nèi)標(biāo)法，與己知對照物進行定性，鑒定酪蛋白酶解產(chǎn)物中的免疫調(diào)節(jié)肽。酶解上清液

2、經(jīng)SephadexG-15凝膠層析分離，得到不同級分，然后用RP-HPLC鑒定各級分中的免疫調(diào)節(jié)肽。 結(jié)果：酪蛋白在胰蛋白酶與糜蛋白酶組合下水解90分鐘，能產(chǎn)生PGPIPN量最多，大約5％。酶解產(chǎn)物經(jīng)SephadexG-15凝膠層析后，酶解產(chǎn)物中小分子物質(zhì)被分開，經(jīng)RP-HPLC檢測，SephadexG-15的第5級分含有免疫調(diào)節(jié)肽。 結(jié)論：酪蛋白經(jīng)過胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解后可以生成免疫調(diào)節(jié)肽，并可以通過Sephadex

3、G-15粗分免疫調(diào)節(jié)肽。 2.乳源免疫調(diào)節(jié)肽對大鼠生長和機體免疫的影響 目的：探討乳源免疫調(diào)節(jié)肽對大鼠機體免疫功能，增重和采食量的影響。 方法：42只40日齡的SD大鼠(雌雄各一半)隨機分為兩個試驗組和一個對照組，每組14只雌雄各一半，分開飼養(yǎng)。預(yù)飼一周后，實驗組分別被灌喂2.5×10-3g·L-1免疫調(diào)節(jié)肽(試驗組Ⅰ)、2.5×10-2g·L-1免疫調(diào)節(jié)肽(試驗組Ⅱ)；對照組灌喂生理鹽水，并記錄大鼠日采食量和體

4、重。飼養(yǎng)一個月后分別檢測對照組和試驗組的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、紅細(xì)胞免疫、巨噬細(xì)胞吞噬、日采食量和體重等的差別。 結(jié)果：乳源免疫調(diào)節(jié)肽對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬和紅細(xì)胞免疫有顯著促進功能(p＜0.05)；而對淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用有增長的趨勢，但未達到顯著水平(p＞0.05)。與對照組相比，實驗組Ⅱ的大鼠日采食量顯著地增加(P＜0.05)，雌雄大鼠分別提高了10.95％和8.03％；增重率有提高的趨勢，雌雄大鼠增重率分別提高了5.13％和7.10

5、％，但均未達顯著水平(P＞0.05)。實驗組Ⅰ的大鼠，其日采食量和增重與對照組相比均變化不大。 結(jié)論：免疫調(diào)節(jié)肽能促進機體的免疫功能，提高其免疫力；增加大鼠日采食量。 3.乳源免疫調(diào)節(jié)肽對機體抗氧化及抗疲勞的研究 目的：研究乳源免疫調(diào)節(jié)肽(PGPIPN)對小鼠抗氧化及抗疲勞方面的作用。 方法：90只昆明雄性小鼠用生理鹽水預(yù)飼一周后，隨機分為三組，分別為對照組、實驗組和Ⅰ和實驗組Ⅱ，30只/組，分別灌喂生理

6、鹽水、2.5×10-3g·L-1免疫調(diào)節(jié)肽和2.5×10-2g·L-1免疫調(diào)節(jié)肽，隔天灌喂一次，1mL/只。連續(xù)2w后，末次給藥30min后，取對照組和實驗組各10只進行小鼠負(fù)重游泳試驗，并記錄游泳時間。觀察小鼠血清和組織中超氧化物歧化酶(SOD)和總抗氧化能力(T-AOC)活性及過氧化脂質(zhì)產(chǎn)物——丙二醛(MDA)含量的變化；同時檢測擬疲勞小鼠血清與組織中總?cè)樗崦摎涿?LD)和肌酸激酶(CK)的活性。 結(jié)果：飼喂免疫調(diào)節(jié)肽能提高

7、小鼠SOD活性、T-AOC和降低MDA含量(P＜0.05)，并有劑量依賴關(guān)系。同時飼喂免疫調(diào)節(jié)肽的小鼠明顯能延長負(fù)重游泳時間(P＜0.05或P＜0.01)，肌肉、肝臟組織的LD活性顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，而且也有劑量依賴反應(yīng)關(guān)系，肌肉組織的CK活性明顯降低(P＜0.05)。 結(jié)論：飼喂乳源免疫調(diào)節(jié)肽能加強小鼠的抗氧化能力和延緩機體衰老，同時具有增強機體抗疲勞能力。 4.乳源免疫調(diào)節(jié)肽對腫瘤細(xì)胞SKOV3的

8、體外抑制作用的研究 目的：探討乳源免疫調(diào)節(jié)肽(PGPIPN)對體外培養(yǎng)的人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞系SKOV3的增殖抑制作用，及其抗腫瘤作用的機理。 方法：應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測不同濃度乳源免疫調(diào)節(jié)肽(PGPIPN)對體外培養(yǎng)的人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞株的生長抑制作用，于24h、48h、72h及96h觀察細(xì)胞的生長情況。采用HE染色、透射電鏡觀察、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及凋亡率。

9、 結(jié)果：乳源免疫調(diào)節(jié)肽(PGPIPN)對SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用呈時間和濃度依賴性，3×10-3g·L-1和3×10-4g·L-1PGPIPN作用96小時后，細(xì)胞的生長抑制率分別達27％和25.6％。HE染色、電子顯微鏡均觀察到用藥后凋亡細(xì)胞典型的形態(tài)學(xué)特征。細(xì)胞凋亡率以PGPIPN3×10-4g.L-1組最高，達29.4％。 結(jié)論：在體外，乳源免疫調(diào)節(jié)肽可抑制人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞系SKOV3的增殖，并可誘導(dǎo)其凋亡。