羊胎盤(pán)免疫調(diào)節(jié)因子SPIF-Ⅰ分離純化和鑒定初步研究.pdf

1、近年來(lái)羊胎盤(pán)提取液的研究引起了廣大學(xué)者濃厚的興趣，但這些研究只是集中在羊胎盤(pán)提取液的功能和應(yīng)用方面。羊胎盤(pán)中含有的生物活性組分非常豐富，羊胎盤(pán)提取液中究竟哪些成分在免疫調(diào)節(jié)中起主導(dǎo)作用及如何從中分離純化出單一活性組分等方面的研究一直未見(jiàn)報(bào)道。為此，我們開(kāi)展本課題的研究，主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 1.羊胎盤(pán)免疫調(diào)節(jié)活性因子(SPIF-Ⅰ)的分離與純化 將本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)勻漿、凍融、超慮等步驟制備的分子量小于5000道爾頓的

2、羊胎盤(pán)提取液，首先以20mg/ml濃度上樣于SephadexG-50(柱高100cm，直徑1cm)凝膠柱層析，pH7.4濃度為0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液以0.5ml/min流速進(jìn)行洗脫。結(jié)果得到洗脫峰A和B，反相HPLC檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)洗脫峰B含組分較少，只有兩個(gè)主要成分峰，便于進(jìn)一步分離。多次重復(fù)此步并將洗脫峰B收集，凍干，再經(jīng)SephadexG-25凝膠柱(柱高60cm，直徑1cm)層析，上樣濃度、緩沖液的濃度、pH以及

3、洗脫流速均同樣于SephadexG-50凝膠層析.結(jié)果得到洗脫峰C和D，反相HPLC檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)此次層析恰好將洗脫峰B中的兩個(gè)主要成分峰分開(kāi)。將洗脫峰C、D收集凍干，分別命名為羊胎盤(pán)免疫調(diào)節(jié)因子-Ⅱ和Ⅰ.將兩因子凍干粉再經(jīng)SephadexG-10(柱高30cm，直徑1.5cm)凝膠柱脫鹽后，反相HPLC柱檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)此步層析不僅達(dá)到脫鹽效果，峰C、D中的其它一些含量較小的組分也被分離開(kāi)來(lái)，層析出的目的組分羊胎盤(pán)免疫調(diào)節(jié)因子-Ⅰ和Ⅱ純度

4、進(jìn)一步得到提高，分別達(dá)到98.89％和88.51％。因羊胎盤(pán)免疫調(diào)節(jié)因子-Ⅰ的純度較高，將對(duì)其進(jìn)行深入研究。 2.羊胎盤(pán)免疫調(diào)節(jié)活性因子(SPIF-Ⅰ)的光譜、質(zhì)譜檢測(cè) 將SPIF-Ⅰ稀釋在波長(zhǎng)100～400nm進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果顯示在273nm處有單一特征吸收峰。SPIF-Ⅰ經(jīng)ESI-MS質(zhì)譜分析，m/z304.8為其單電荷峰[M+H]+，所以SPIF-Ⅰ的分子量為303.8。SPIF-Ⅰ的光譜、質(zhì)譜圖譜均顯示SP

5、IF-Ⅰ為組分單一、純度較高的小分子多肽。 3.免疫活性檢測(cè)E—玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)條件的篩選 參照文獻(xiàn)，對(duì)免疫活性測(cè)定脫E受體法中兩個(gè)影響玫瑰花環(huán)形成的重要因素—脫E受體和受體重新合成時(shí)間分別設(shè)時(shí)間點(diǎn)，45℃恒溫水浴脫E受體的時(shí)間設(shè)30min，45min，60min三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，37℃水浴E受體重新合成的時(shí)間設(shè)60min，90min，120min三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。兩實(shí)驗(yàn)條件相互組合共形成9個(gè)實(shí)驗(yàn)組，其它實(shí)驗(yàn)條件參照文獻(xiàn)進(jìn)行E玫瑰花

6、環(huán)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果當(dāng)45℃水浴脫E受體時(shí)間為45min，37℃水浴E受體重新合成時(shí)間為90min時(shí)，樣品管比對(duì)照管的淋巴細(xì)胞玫瑰花結(jié)率高17.3％(P＜0.01).此實(shí)驗(yàn)條件下玫瑰花環(huán)形成率增加值最大。 4.羊胎盤(pán)提取液及其活性組分SPIF-Ⅰ對(duì)E-玫瑰花環(huán)形成率的效應(yīng) 將羊胎盤(pán)提取液以1g·L-1為起始濃度，倍比稀釋為0.50、0.250、0.125g·L-1四個(gè)濃度，SPIF-Ⅰ以4mg·L-1為起始濃度，稀釋為1、0

7、.4、0.2、0.1、0.05mg·L-1共六個(gè)濃度。以篩選出的條件進(jìn)行E-玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，人外周血T淋巴細(xì)胞在脫E受體前玫瑰花環(huán)形成率均值為64.7％，脫E受體后均值下降至46.5％，兩組間差異極顯著(P＜0.01)。羊胎盤(pán)提取液在0.125～1g·L-1濃度時(shí)能顯著提高T淋巴細(xì)胞的E玫瑰花環(huán)形成率并且淋巴細(xì)胞花環(huán)形成率與SPE刺激劑量存在非線性關(guān)系，羊胎盤(pán)提取液在篩選的實(shí)驗(yàn)條件下能很好地檢測(cè)出免疫活性。 從不同濃度

8、的SPIF-Ⅰ與脫E受體后的T淋巴細(xì)胞溫浴后玫瑰花環(huán)形成率均值回升結(jié)果可見(jiàn)，SPIF-Ⅰ能顯著提高T淋巴細(xì)胞的E玫瑰花環(huán)形成率，在0.05～0.2mg·L-1時(shí)，脫受體后形成的玫瑰花環(huán)試驗(yàn)差值大于10％，并具有明顯的劑量—效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系. 5.MTT法測(cè)定SPIF-Ⅰ對(duì)BALB/c小鼠正常脾淋巴細(xì)胞分裂增殖的效應(yīng) 參照文獻(xiàn)無(wú)菌條件下制備濃度為1～2×106個(gè)/mL的小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，SPIF-Ⅰ以6.0μg/ml為起

9、始濃度，倍比稀釋法稀釋六個(gè)濃度梯度，陰性對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組分別以1640培養(yǎng)液和胸腺肽注射液(1mg/mL)代替SPIF-Ⅰ，以MTT法進(jìn)行刀豆蛋白(ConA)誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示3～0.75μg/mL濃度的SPIF-Ⅰ能顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞分裂增殖，并具有明顯的劑量—效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系.與胸腺肽注射液相比，1.5μg/mL的SPIF-Ⅰ與1mg/mL的胸腺肽(文獻(xiàn)報(bào)道[10～11]的胸腺肽最適作用濃度)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的分裂

10、增殖影響效應(yīng)相當(dāng)。 結(jié)論： 1.羊胎盤(pán)提取液依次經(jīng)過(guò)SephadexG-50、SephadexG-25凝膠柱層析，SephadexG-10凝膠柱脫鹽可獲得組分單一、純度較高的SPIF-Ⅰ。 2.在篩選的條件——脫E受體時(shí)間為45min，E受體重新合成時(shí)間為90min時(shí)，進(jìn)行E-玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)，SPIF-Ⅰ同羊胎盤(pán)提取液一樣能顯著促進(jìn)人外周血T淋巴細(xì)胞E玫瑰花環(huán)形成，具有明顯的劑量—效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系。