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文檔簡介
1、近年來羊胎盤提取液的研究引起了廣大學者濃厚的興趣,但這些研究只是集中在羊胎盤提取液的功能和應用方面。羊胎盤中含有的生物活性組分非常豐富,羊胎盤提取液中究竟哪些成分在免疫調(diào)節(jié)中起主導作用及如何從中分離純化出單一活性組分等方面的研究一直未見報道。為此,我們開展本課題的研究,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下: 1.羊胎盤免疫調(diào)節(jié)活性因子(SPIF-Ⅰ)的分離與純化 將本實驗室通過勻漿、凍融、超慮等步驟制備的分子量小于5000道爾頓的
2、羊胎盤提取液,首先以20mg/ml濃度上樣于SephadexG-50(柱高100cm,直徑1cm)凝膠柱層析,pH7.4濃度為0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液以0.5ml/min流速進行洗脫。結(jié)果得到洗脫峰A和B,反相HPLC檢測分析發(fā)現(xiàn)洗脫峰B含組分較少,只有兩個主要成分峰,便于進一步分離。多次重復此步并將洗脫峰B收集,凍干,再經(jīng)SephadexG-25凝膠柱(柱高60cm,直徑1cm)層析,上樣濃度、緩沖液的濃度、pH以及
3、洗脫流速均同樣于SephadexG-50凝膠層析.結(jié)果得到洗脫峰C和D,反相HPLC檢測分析發(fā)現(xiàn)此次層析恰好將洗脫峰B中的兩個主要成分峰分開。將洗脫峰C、D收集凍干,分別命名為羊胎盤免疫調(diào)節(jié)因子-Ⅱ和Ⅰ.將兩因子凍干粉再經(jīng)SephadexG-10(柱高30cm,直徑1.5cm)凝膠柱脫鹽后,反相HPLC柱檢測分析,發(fā)現(xiàn)此步層析不僅達到脫鹽效果,峰C、D中的其它一些含量較小的組分也被分離開來,層析出的目的組分羊胎盤免疫調(diào)節(jié)因子-Ⅰ和Ⅱ純度
4、進一步得到提高,分別達到98.89%和88.51%。因羊胎盤免疫調(diào)節(jié)因子-Ⅰ的純度較高,將對其進行深入研究。 2.羊胎盤免疫調(diào)節(jié)活性因子(SPIF-Ⅰ)的光譜、質(zhì)譜檢測 將SPIF-Ⅰ稀釋在波長100~400nm進行紫外掃描,結(jié)果顯示在273nm處有單一特征吸收峰。SPIF-Ⅰ經(jīng)ESI-MS質(zhì)譜分析,m/z304.8為其單電荷峰[M+H]+,所以SPIF-Ⅰ的分子量為303.8。SPIF-Ⅰ的光譜、質(zhì)譜圖譜均顯示SP
5、IF-Ⅰ為組分單一、純度較高的小分子多肽。 3.免疫活性檢測E—玫瑰花環(huán)實驗條件的篩選 參照文獻,對免疫活性測定脫E受體法中兩個影響玫瑰花環(huán)形成的重要因素—脫E受體和受體重新合成時間分別設時間點,45℃恒溫水浴脫E受體的時間設30min,45min,60min三個時間點,37℃水浴E受體重新合成的時間設60min,90min,120min三個時間點。兩實驗條件相互組合共形成9個實驗組,其它實驗條件參照文獻進行E玫瑰花
6、環(huán)實驗。結(jié)果當45℃水浴脫E受體時間為45min,37℃水浴E受體重新合成時間為90min時,樣品管比對照管的淋巴細胞玫瑰花結(jié)率高17.3%(P<0.01).此實驗條件下玫瑰花環(huán)形成率增加值最大。 4.羊胎盤提取液及其活性組分SPIF-Ⅰ對E-玫瑰花環(huán)形成率的效應 將羊胎盤提取液以1g·L-1為起始濃度,倍比稀釋為0.50、0.250、0.125g·L-1四個濃度,SPIF-Ⅰ以4mg·L-1為起始濃度,稀釋為1、0
7、.4、0.2、0.1、0.05mg·L-1共六個濃度。以篩選出的條件進行E-玫瑰花環(huán)實驗。結(jié)果顯示,人外周血T淋巴細胞在脫E受體前玫瑰花環(huán)形成率均值為64.7%,脫E受體后均值下降至46.5%,兩組間差異極顯著(P<0.01)。羊胎盤提取液在0.125~1g·L-1濃度時能顯著提高T淋巴細胞的E玫瑰花環(huán)形成率并且淋巴細胞花環(huán)形成率與SPE刺激劑量存在非線性關系,羊胎盤提取液在篩選的實驗條件下能很好地檢測出免疫活性。 從不同濃度
8、的SPIF-Ⅰ與脫E受體后的T淋巴細胞溫浴后玫瑰花環(huán)形成率均值回升結(jié)果可見,SPIF-Ⅰ能顯著提高T淋巴細胞的E玫瑰花環(huán)形成率,在0.05~0.2mg·L-1時,脫受體后形成的玫瑰花環(huán)試驗差值大于10%,并具有明顯的劑量—效應依賴關系. 5.MTT法測定SPIF-Ⅰ對BALB/c小鼠正常脾淋巴細胞分裂增殖的效應 參照文獻無菌條件下制備濃度為1~2×106個/mL的小鼠脾淋巴細胞懸液,SPIF-Ⅰ以6.0μg/ml為起
9、始濃度,倍比稀釋法稀釋六個濃度梯度,陰性對照組與陽性對照組分別以1640培養(yǎng)液和胸腺肽注射液(1mg/mL)代替SPIF-Ⅰ,以MTT法進行刀豆蛋白(ConA)誘導的脾淋巴細胞增殖實驗。結(jié)果顯示3~0.75μg/mL濃度的SPIF-Ⅰ能顯著促進小鼠脾淋巴細胞分裂增殖,并具有明顯的劑量—效應依賴關系.與胸腺肽注射液相比,1.5μg/mL的SPIF-Ⅰ與1mg/mL的胸腺肽(文獻報道[10~11]的胸腺肽最適作用濃度)對小鼠脾淋巴細胞的分裂
10、增殖影響效應相當。 結(jié)論: 1.羊胎盤提取液依次經(jīng)過SephadexG-50、SephadexG-25凝膠柱層析,SephadexG-10凝膠柱脫鹽可獲得組分單一、純度較高的SPIF-Ⅰ。 2.在篩選的條件——脫E受體時間為45min,E受體重新合成時間為90min時,進行E-玫瑰花環(huán)形成實驗,SPIF-Ⅰ同羊胎盤提取液一樣能顯著促進人外周血T淋巴細胞E玫瑰花環(huán)形成,具有明顯的劑量—效應依賴關系。
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