下調Smad4基因對呼吸機相關性肺損傷細胞外基質重塑的影響.pdf

1、目的:
　　機械通氣(mechanicalventilation，MV)在呼吸危重癥患者的救治過程中起著至關重要的作用，呼吸機的不恰當使用可引起或加重肺損傷，即呼吸機相關性肺損傷(ventilatorinducedlunginjury，VILI)。明確VILI的發(fā)生機制對于提高危重病患者的救治水平及生存率有著十分重要的臨床價值。本實驗通過建立VILI的動物模型，探討TGF-β/Smad信號通路在VILI模型中對小鼠肺組織細胞外基質

2、重塑的可能作用機制。
　　方法:
　　將24只6-8周齡的C57BL/6小鼠隨機分為四組，即正常對照組（Ⅰ組）、單純機械通氣組（Ⅱ組）、病毒陰性對照加機械通氣組（Ⅲ組）和Smad4siRNA病毒加機械通氣組（Ⅳ組），每組6只。實驗過程中，將小鼠充分麻醉，通過病毒滴鼻的方法使小鼠肺部分別感染Smad4siRNA病毒及陰性對照病毒從而建立慢病毒模型;4周后，對機械通氣組小鼠進行大潮氣量機械通氣(VT=40mL/kg)建立呼吸機相

3、關性肺損傷模型。將小鼠充分麻醉，暴露頸部皮膚，常規(guī)酒精消毒行氣管切開，插管固定好后，連接小動物呼吸機以行機械通氣，其中潮氣量設置為40mL/kg，通氣時間設置為4h。通氣結束后72h將小鼠充分麻醉，固定小鼠四肢，充分暴露胸腹部，剖開小鼠胸腹腔，剪斷腹主動脈，待其流血至死，生理鹽水充分灌洗后取出左右雙肺。RealTime-PCR和Westernblot法分別檢測Smad4mRNA與蛋白的表達檢驗慢病毒是否成功感染小鼠肺部組織。制作石蠟切片

4、后行蘇木素-伊紅(Haematoxylin-eosine，HE)染色觀察小鼠肺組織病理學變化，評價肺損傷的嚴重程度，Masson染色觀察比較各組小鼠肺組織膠原纖維的沉積量，免疫組織化學方法檢測α-SMA表達，RealTime-PCR和Westernblot法分別檢測肺組織中o-SMA、膠原Ⅰ、膠原ⅢmRNA與蛋白的表達量。
　　結果:
　　Smad4siRNA加機械通氣組（Ⅳ組）中肺組織的Smad4mRNA和蛋白的表達量明顯

5、低于單純機械通氣組（Ⅱ組）與病毒陰性對照加機械通氣組（Ⅲ組）(P＜0.05)，證明Smad4慢病毒成功感染至小鼠肺組織。單純機械通氣組（Ⅱ組）與病毒陰性對照加機械通氣組（Ⅲ組）其炎性細胞浸潤及膠原纖維的沉積較正常組嚴重，Smad4siRNA加機械通氣組(Ⅳ組)中卻有明顯改善（P＜0.05）。單純機械通氣組（Ⅱ組）與病毒陰性對照加機械通氣組（Ⅲ組）α-SMA、膠原Ⅰ、膠原ⅢmRNA與蛋白的表達明顯高于正常組（P＜0.05），Ⅳ組較之有所減

6、少(P＜0.05)。單純機械通氣組（Ⅱ組）與病毒陰性對照加機械通氣組(Ⅲ組)之間，無論是炎性細胞浸潤與膠原沉積，還是Smad4、α-SMA、膠原Ⅰ、膠原ⅢmRNA與蛋白的表達量差異都沒有明顯的統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明陰性對照病毒可能對小鼠肺組織基因的表達無影響。
　　結論:
　　大潮氣量機械通氣會造成呼吸機相關性肺損傷(VILI)，損傷后的肺部組織表現(xiàn)為大量炎性細胞浸潤、膠原纖維沉積及細胞外基質重塑。此過程可能與TG