TGF-β1對hUCMSCs基因表達(dá)譜、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 1.檢測EGF、bFGF、HGF、PDGF和TGF-β1對hUCMSCs增殖和遷移能力的影響。
　　 2.檢測TGF-β1對hUCMSCs基因表達(dá)譜、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響
　　 方法:
　　 1.利用植塊法從人新鮮臍帶中分離培養(yǎng)MSCs。取第5代穩(wěn)定生長的hUCMSCs用流式細(xì)胞儀進(jìn)行免疫表型鑒定。取第5～7代穩(wěn)定生長的hUCMSCs分別置于成骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化

2、來鑒定hUCMSCs多向分化能力。
　　 2.取第5代對數(shù)生長期細(xì)胞,對照組加入不含任何因子的普通培養(yǎng)基,5組實驗組分別加入濃度均為2ng/ml的EGF、bFGF、HGF、PDGF和TGF-β1的培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h后采用WST法檢測490nm波長處測吸光值(OD值)。分組同前,采用體外細(xì)胞劃痕損傷模型和Transwell培養(yǎng)體系檢測并比較五種生長因子對hUCMSCs遷移能力的影響。
　　 3.取第5代對數(shù)生長期細(xì)胞,以1

3、×105/ml密度接種于25cm2的培養(yǎng)瓶。對照組為普通培養(yǎng)基,實驗組加入濃度為0.1ng/ml的TGF-β1,培養(yǎng)24小時后,加入1mlTrizol一步法提取總RNA。利用cDNA芯片技術(shù)檢測hUCMSCs在TGF-β1作用下基因表達(dá)譜的變化。
　　 4.取第5代對數(shù)生長期細(xì)胞,八個實驗組分別加入濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、和20.0ng/ml的TGF-β1,對照組為普通培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)24

4、、48、72個小時后采用WST法檢測490nm波長處OD值。取第5代對數(shù)生長期細(xì)胞,三個實驗組分別加入0.1、0.5和1.0ng/ml的TGF-β1,對照組為普通培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時后,實時定量PCR檢測hUCMSCs細(xì)胞外基質(zhì)mRNA表達(dá)情況。采用免疫組化的方法檢測TGF-β1對Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、FN和LN表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.1原代培養(yǎng)細(xì)胞7d后顯微鏡下可見明顯粘附培養(yǎng)瓶壁生長,成纖維樣,有偽足

5、伸出,有折光性、核仁明顯,15天時細(xì)胞達(dá)到70％～80％融合,形態(tài)變?yōu)榫坏募忓N形。傳代后細(xì)胞4～5個小時左右即可貼壁,傳代2～3次后能獲得形態(tài)均一的細(xì)胞,排列具有明顯的方向性,呈放射或旋渦狀生長。
　　 1.2根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果,所獲得的貼壁細(xì)胞不表達(dá)CD34和CD45,高表達(dá)CD44、CD71、CD90和CD105。
　　 1.3堿性磷酸酶染色和茜素紅S染色證實細(xì)胞可向成骨細(xì)胞分化;細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)油紅O陽性的脂肪顆粒

6、說明細(xì)胞可向脂肪細(xì)胞分化。
　　 2.1在細(xì)胞檢測中,實驗組hUCMSCs較對照組細(xì)胞數(shù)均是增加的。在各實驗組中,HGF組細(xì)胞數(shù)最多。
　　 2.2在細(xì)胞劃痕損傷實驗中,hUCMSCs在實驗組培養(yǎng)基中培養(yǎng)遷移24h后,其遷移距離較對照組均是增加的,其中HGF組遷移距離最長。
　　 2.3在Transwell移行實驗中,各實驗組膜下的細(xì)胞數(shù)較對照組均增加,其中bFGF組膜下的細(xì)胞數(shù)最多。
　　 3.差異表達(dá)

7、基因共有296個,其中上調(diào)基因153個,下調(diào)基因143個,其中在上調(diào)基因中有9個基因與細(xì)胞運動、遷移相關(guān)。通過差異基因的Pathway和Go的統(tǒng)計分析,顯示差異基因涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯、生物合成、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞間連接等多方面。
　　 4.1在細(xì)胞增殖實驗中,隨著TGF-β1濃度的上升,OD值并未呈現(xiàn)明確的量效關(guān)系,而是呈波浪樣變化,變化均不顯著。各時間段OD值在0.1ng/ml組均會出現(xiàn)相對峰值。
　　 4.2

8、在qRT-PCR試驗中,Col-Ⅰ、MMP-2、MMP-9和TIMP-2的表達(dá)在0.5ng/ml組達(dá)到峰值。其它成分:Col-Ⅳ、FN、LN、Integrin、Tenascin-C、MMP-1和TIMP-1均在0.1ng/ml組達(dá)到峰值。
　　 4.3在免疫組化實驗中,Col-Ⅰ和Col-Ⅳ分別在0.5ng/ml組和0.1ng/ml組少量表達(dá).FN在0.1ng/ml和0.5ng/ml組均強烈表達(dá),二者無明顯差異。LN在0.1ng

9、/ml和0.5ng/ml組均無明顯表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.2ng/ml的EGF、bFGF、HGF、PDGF和TGF-β1均能促進(jìn)hUCMSCs增殖和遷移。
　　 2.TGF-β1對hUCMSCs的轉(zhuǎn)錄、翻譯、生物合成、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞間連接等多方面在基因水平上具有調(diào)節(jié)作用并能通過上調(diào)肌動蛋白、微管蛋白、RhoA的基因表達(dá)來提高h(yuǎn)UCMSCs的遷移能力。
　　 3.0.1ng/ml的T