生酮飲食對(duì)杏仁核點(diǎn)燃癲癇形成的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 癲癇(Epilepsy)是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)病，其特點(diǎn)是神經(jīng)元的異常放電。臨床上大多數(shù)癲癇患者可以接受藥物治療控制癲癇發(fā)作，但仍有20％～30%的患者經(jīng)藥物治療后難以得到有效控制。雖然抗癲癇藥不斷研發(fā)，但對(duì)于難治性癲癇，新型抗癲癇藥治療的療效仍然有限，需要尋找其它的治療手段和方法。生酮飲食(Ketogenicdiet，KD)成為了研究的熱點(diǎn)。
　　 KD是一種高脂肪、低碳水化合物、低蛋白的飲食，目前認(rèn)

2、為KD是一種治療藥物難治性癲癇的安全有效的治療手段，它對(duì)多種癲癇和癲癇綜合癥有效。盡管目前臨床證實(shí)KD治療癲癇有效，但KD的機(jī)制并不明確。研究KD的機(jī)制能讓KD的過(guò)程更簡(jiǎn)化、更合理，減少潛在的嚴(yán)重副作用，提高對(duì)正常腦和癲癇活動(dòng)時(shí)的代謝及生理基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)。進(jìn)一步驗(yàn)證KD，也能為今后其它的治療手段提供參考。
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是研究KD機(jī)制的重要手段，點(diǎn)燃模型能很好模擬人類復(fù)雜部分性及繼發(fā)全面性顳葉癲癇，除了能根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇多個(gè)刺激點(diǎn)以

3、外，它還能用于研究點(diǎn)燃建立過(guò)程中的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化，在研究癲癇的發(fā)生過(guò)程中有其它模型無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，但目前尚無(wú)KD作用于杏仁核點(diǎn)燃過(guò)程的研究。本研究擬選用杏仁核電點(diǎn)燃癲癇的模型來(lái)研究KD在抗癲癇形成過(guò)程中的作用，并觀察KD對(duì)癲癇形成過(guò)程的神經(jīng)保護(hù)作用及對(duì)苔蘚纖維發(fā)芽的作用。
　　 癲癇放電會(huì)導(dǎo)致大量的激活后效應(yīng)，包括各種神經(jīng)遞質(zhì)、受體、離子通道、細(xì)胞內(nèi)信使和神經(jīng)因子的mRNA和蛋白的改變。目前認(rèn)為BDNF參與及調(diào)節(jié)了與癲癇的病理

4、生理有關(guān)的許多機(jī)制，包括神經(jīng)生長(zhǎng)、神經(jīng)突觸的形成或調(diào)節(jié)興奮性及抑制性的遞質(zhì)。糖酵解抑制劑2DG和FDP都能影響B(tài)DNF的基因表達(dá)，我們?nèi)圆磺宄﨣D是否直接通過(guò)抑制BDNF的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗癲癇形成的作用。GABAA受體主要位于突觸后膜上，介導(dǎo)快速突觸后抑制。在癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中，BDNF調(diào)節(jié)JAK/STAT3通路影響GABAAα1亞單位表達(dá)的下降。STAT3通路是顳葉癲癇的形成過(guò)程中一條重要的細(xì)胞傳導(dǎo)途徑，參與顳葉癲癇突觸可塑性的重建機(jī)制。

5、我們推測(cè)BDNF可能在KD抑制杏仁核點(diǎn)燃及KD對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)和對(duì)苔蘚纖維發(fā)芽的抑制過(guò)程中發(fā)揮了調(diào)控作用，并有可能是通過(guò)STAT3通路影響GABAA受體起作用的。
　　 第一部分，生酮飲食對(duì)杏仁核電點(diǎn)燃模型的作用
　　 目的：
　　 觀察生酮飲食在杏仁核慢性點(diǎn)燃過(guò)程中對(duì)癲癇形成的作用，同時(shí)，觀察生酮飲食對(duì)杏仁核點(diǎn)燃模型海馬及旁海馬區(qū)神經(jīng)元丟失和對(duì)海馬苔蘚纖維發(fā)芽的影響。
　　 方法：
　　 1.

6、P28天SD大鼠按體重配對(duì)后分入KD組及ND組，喂食Ketocal及正常食物各4周，每隔2天測(cè)定體重，每周測(cè)定血β-羥丁酸。P56天手術(shù)，電極植入基底旁杏仁核，術(shù)后休息10天，進(jìn)入電點(diǎn)燃程序。
　　 2.兩組大鼠測(cè)定初始后放電閾值(ADT)，每天1次予以各自的初始ADT為刺激強(qiáng)度的電流刺激，誘發(fā)出癲癇發(fā)作，共20天。每天記錄行為、根據(jù)Racine分級(jí)判定刺激后發(fā)作等級(jí)、后放電時(shí)程(ADD)、大發(fā)作潛伏期(GSL)等參數(shù)，每隔5天

7、測(cè)定一次ADT。
　　 3.經(jīng)麻醉灌注后，兩組大鼠各取刺激前(Sti0)和刺激20次(Sti20)后兩小時(shí)腦組織標(biāo)本，處理后冰凍切片，行Nissl染色和Timm染色，觀察海馬及旁海馬區(qū)神經(jīng)元丟失情況及海馬內(nèi)分子層苔蘚纖維發(fā)芽情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.兩組大鼠喂養(yǎng)過(guò)程中體重均增加，但KD組大鼠體重明顯低于ND組。KD組大鼠除了皮毛油性多、脫毛外，其它生物學(xué)及行為學(xué)特征上和ND組比較并無(wú)顯著區(qū)別。血β羥丁酸比較

8、顯示KD大鼠進(jìn)食生酮飲食后血酮體水平很快明顯增高，1周后達(dá)到持續(xù)酮血癥的穩(wěn)定狀態(tài)，而ND組大鼠基本保持在一個(gè)相對(duì)比較低的酮體狀態(tài)。
　　 2.隨著刺激次數(shù)的累加，兩組大鼠行為學(xué)上均出現(xiàn)一系列的變化，發(fā)作等級(jí)總體上不斷增加，ADD不斷延長(zhǎng)。生酮飲食顯著延緩杏仁核點(diǎn)燃過(guò)程發(fā)作等級(jí)和ADD的增加。KD組停留在0級(jí)、2級(jí)的天數(shù)長(zhǎng)于ND組。KD組達(dá)到2、3、4、5級(jí)所需要的刺激數(shù)均多于ND組。KD組比ND組在部分性癲癇階段(1～3級(jí))停留

9、更長(zhǎng)的時(shí)間，KD組發(fā)生大發(fā)作的發(fā)生率比ND組低。一旦被點(diǎn)燃，兩組大發(fā)作的潛伏期無(wú)差異。隨著刺激次數(shù)的增加，兩組大鼠均出現(xiàn)ADT逐漸降低，KD對(duì)第5天的ADT降低有減緩作用，而這種作用在第10天和第15天消失。
　　 3.點(diǎn)燃前神經(jīng)元密度KD組雙側(cè)海馬CA1區(qū)和刺激同側(cè)DG區(qū)的神經(jīng)元密度比ND組對(duì)應(yīng)區(qū)域要小，但兩組內(nèi)嗅皮層和梨狀皮層神經(jīng)元密度無(wú)差異。
　　 4.隨著電刺激次數(shù)的逐漸增加，ND組大鼠海馬及旁海馬區(qū)神經(jīng)元密度顯

10、著降低，在旁海馬區(qū)，ND組大鼠刺激同側(cè)梨狀皮層神經(jīng)元丟失，而刺激前后對(duì)側(cè)梨狀皮層神經(jīng)元無(wú)明顯丟失。刺激同側(cè)和刺激對(duì)側(cè)的內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元均有不同程度丟失。電流刺激20次后，KD組相比于ND組能減少同側(cè)海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元丟失。但在CA、DG區(qū)或海馬旁區(qū)，KD沒(méi)有顯示出這種保護(hù)作用。
　　 5.兩組大鼠刺激前同側(cè)或刺激對(duì)側(cè)海馬CA3區(qū)Timm評(píng)分組間比較無(wú)顯著差異，同一組內(nèi)刺激同側(cè)與刺激對(duì)側(cè)也無(wú)差異。電流刺激20次后，ND組刺激同側(cè)T

11、imm分值有增高。KD組刺激同側(cè)或?qū)?cè)刺激前后無(wú)變化。
　　 結(jié)論：
　　 1.KD在杏仁核點(diǎn)燃模型癲癇的形成過(guò)程中有抗癲癇發(fā)生作用，可能是通過(guò)抑制后放電的形成起作用，這種作用主要發(fā)生在癲癇的部分性階段。
　　 2.KD能減少杏仁核點(diǎn)燃模型中輕-中度的海馬區(qū)神經(jīng)元的丟失，但對(duì)旁海馬皮層無(wú)保護(hù)作用。
　　 3.KD可能通過(guò)抑制海馬的MFS而起到抗癲癇發(fā)生的作用。
　　 第二部分，生酮飲食抗癲癇發(fā)生機(jī)

12、制的初步探討
　　 目的：
　　 揭示KD在杏仁核點(diǎn)燃癲癇形成過(guò)程中通過(guò)對(duì)BDNF/STAT3/GABAA受體的影響來(lái)發(fā)揮抗癲癇形成或神經(jīng)保護(hù)的作用。
　　 方法：
　　 1.通過(guò)Real-timeqPCR測(cè)定喂食ND及KD兩組大鼠海馬杏仁核點(diǎn)燃模型各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(電刺激0次、6次、12次、20次)BDNF、STAT3、GABAAα1受體(Gabral)和GABAAα4受體(Gabra4)基因mRNA表達(dá)的變

13、化；
　　 2.通過(guò)Westernblot方法半定量檢測(cè)兩組大鼠海馬杏仁核點(diǎn)燃各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(電刺激0次、6次、12次、20次)BDNF、總STAT3蛋白及磷酸化的pSTAT3的蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.喂食正常食物大鼠BDNFmRNA隨著杏仁核點(diǎn)燃過(guò)程的發(fā)展增高，在電刺激12次和20次相比電刺激前出現(xiàn)表達(dá)量的明顯增高；KD組大鼠BDNF的增高不明顯，在電刺激12次和電刺激20次，BDNF的mRNA表達(dá)

14、量均低于ND組。
　　 2.隨著點(diǎn)燃次數(shù)的增加，正常對(duì)照大鼠的BDNF蛋白表達(dá)量增加，在KD組大鼠中，BDNF也出現(xiàn)隨點(diǎn)燃過(guò)程的發(fā)展而表達(dá)增高的趨勢(shì)，相比于ND大鼠，KD組在點(diǎn)燃第6次BDNF的蛋白量較少。
　　 3.隨著電刺激的次數(shù)的增加，ND組大鼠STAT3mRNA表達(dá)量基本無(wú)變化；KD組大鼠在電刺激6次、12次和20次STAT3的mRNA表達(dá)量均高于同一時(shí)間點(diǎn)ND組。
　　 4.ND組大鼠總的STAT3蛋白

15、量基本無(wú)變化，而pSTAT3的表達(dá)量隨著時(shí)間逐漸增加；KD組大鼠pSTAT3在點(diǎn)燃早期就處于相對(duì)較高的表達(dá)量，隨著點(diǎn)燃的發(fā)展，pSTAT3的表達(dá)量基本保持不變。
　　 5.兩組大鼠的Gabra1和Gabra4基因表達(dá)在杏仁核點(diǎn)燃各個(gè)時(shí)間點(diǎn)變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.杏仁核點(diǎn)燃過(guò)程中ND大鼠BDNF的基因表達(dá)和蛋白翻譯都呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)增高改變，但兩者并不平行：KD對(duì)BDNFmRNA表達(dá)的影響主要發(fā)生在點(diǎn)